TMPRSS4在胃癌中的表达及其临床意义

赵雪峰，赵美兰，许广大

（大连大学附属新华医院 1. 普通外科；2. 药剂科，辽宁 大连 116021）

多学科综合治疗模式在胃癌诊治的实际应用中暴露出基础与临床结合研究不足的缺点，而且目前对转化医学的研究也寥寥无几［1］。因此，基础医学和临床医学研究间需要建立有效的沟通，尤其要关注基础医学研究成果向临床医学快速转化，以便用最简单、有效的手段确立胃癌高水准的诊治模式。众所周知，侵袭和转移是影响胃癌治疗效果和预后的关键要素［2］。值得说明的是，TMPRSS4在诸多肿瘤中与侵袭和转移有关，但在胃癌的研究报道不多［3］。本研究首先采用实时PCR方法，在RNA或DNA水平上检测正常黏膜和胃癌组织的TMPRSS4表达；而后采用免疫组织化学方法，在蛋白质水平上检测正常胃黏膜、胃腺瘤、原发胃癌及远处转移灶组织的TMPRSS4表达；最后结合临床病理和随访资料分析，评估TMPRSS4能否成为预测转移及预后的生物学指标。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2016年12月大连大学附属新华医院普通外科胃癌手术的30例相对正常胃黏膜和30例胃癌组织新鲜标本，行实时PCR检测TMPRSS4表达前，标本取材后保存在液氮中。再选取2008年1月至2014年12月在我院行胃癌手术或胃息肉EMR/ESD术后蜡块标本，备行免疫组织化学检测TMPRSS4表达，包括30例相对正常胃黏膜、18例胃腺瘤、122例原发胃癌及22例远处转移灶组织。122例原发胃癌中男性80例，女性42例；年龄范围31～79岁，中位年龄63.5岁；肿瘤大小＜4.0 cm 69例，≥4.0 cm 53例；TNM分期I期41例，Ⅱ期28例，Ⅲ期31例，Ⅳ期22例。22例远处转移灶分别为：第12a组淋巴结 （LN#12a） 及以上淋巴结转移10例；其他脏器或组织 （肝脏、肺、腹膜等） 转移12例。病例排除标准： （1）新辅助放化疗者； （2） 同时性多原发胃癌者； （3） 合并其他恶性肿瘤者； （4） 患有活动性结缔组织病者；（5） 针对肿瘤特殊治疗或非初治者； （6） 远处转移灶未能切除或活检者； （7） 门诊或电话随访失联者。

1.2 方法

1.2.1 实时PCR检测：cDNA合成后，进入实时PCR反应体系。TMPRSS4mRNA上游引物 序列5’-CCGATGTGTTCAACTGGAAG-3’，下游引物序列5’-CCCATCCAATGATCCAGAGT-3’； 而GAPDH上游引物 序列5’-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3’，下游引物序列5’-ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT-3’。反应条件：94 ℃ 10 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。结果判定采用LogRQ法进行相对基因表达分析。

1.2.2 免疫组织化学检测及评估标准：采用Polymer Kit （非生物素） 二步法检测TMPRSS4 （Protein Tech公司） 表达，其中TMPRSS4工作浓度为1∶50过夜，并选PBS作为阴性对照。根据细胞染色比例分为：0 （染色细胞比例≤5%） ，1 （染色细胞比例＞5%～25%） ，2 （染色细胞比例＞25%～50%） ，3 （染色细胞比例＞50%） ；根据细胞染色强度分为：0 （未染色） ，1 （轻度染色、浅黄色） ，2 （中度染色、棕黄色） ，3 （重度染色、棕色） 。染色指数=细胞染色比例×细胞染色强度，分别标记为0、1、2、3、4、6及9。当染色指数≥6时，认为TMPRSS4表达呈阳性，反之为阴性。

1.2.3 观察指标： （1） 癌与非癌组织中的TMPRSS4表达； （2） TMPRSS4表达水平与原发性胃癌指标；（3） TMPRSS4表达水平与远处转移灶指标； （4） TMPRSS4表达水平与随访指标。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析。2组临床病理因素比较采用t检验或χ2检验；多变量分析采用Cox 回归分析；原发肿瘤与远处转移灶的TMPRSS4表达相关性分析采用线性回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMPRSS4在胃癌组织和非癌组织中的表达

实时 PCR检测结果，TMPRSS4表达在胃癌组织中显著高于相对正常胃黏膜，差异有统计学意义 （P=0.035） ，见图1。免疫组织化学检测结果，TMPRSS4表达在原发胃癌及远处转移组织中显著高于非癌组织，随着临床分期的增长其表达呈逐渐升高趋势，差异有统计学意义 （P＜ 0.01） ，见图2、3。

图1 胃癌组织与相对正常胃黏膜间TMPRSS4表达比较Fig.1 Relative expression of TMPRSS4 in gastric cancer tissues compared with adjacent normal mucosal tissues

图2 癌与非癌组织的TMPRSS4免疫组织化学染色Fig.2 TMPRSS4 immunohistochemical staining in cases of human gastric cancers and noncancers

图3 癌与非癌的TMPRSS4表达盒形图Fig.3 Boxplot analysis of TMPRSS4 expression levels in cases of human gastric cancer and non-cancer

2.2 TMPRSS4表达与胃癌临床病理因素间的关系

TMPRSS4高表达与肿瘤大小、淋巴血管浸润、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期密切相关 （P＜ 0.05） ，见表1。多变量Cox回归分析显示，TMPRSS4高表达是影响胃癌患者预后的独立因素 （HR= 2.72，P= 0.005） ，见表2。线性回归分析显示，原发肿瘤的TMPRSS4表达与远处转移灶的TMPRSS4表达呈正相关 （β= 0.307，R2=0.143，P=0.025） 。

表1 TMPRSS4表达与临床病理特征Tab.1 Clinicopathological characteristics of patients with versus without TMPRSS4 expression

表2 胃癌预后影响因素的单变量与多变量分析Tab.2 Univariate and multivariate analyses of prognostic factors of gastric cancer

3 讨论

TMPRSS4是新型丝氨酸蛋白酶，也是分泌型蛋白水解酶，其生物学特性及肿瘤演进中的作用机制尚未完全清楚，但在上皮细胞来源的胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌及胃癌的侵袭和转移中的作用渐渐得到了相应的肯定［4-6］。因为TMPRSS4具有多种结构域的结构和水解蛋白酶特性，其可与多种成分发生反应、凝聚成传导信号复合体，关联到胞内、外的多种传导信号途径，且涉及肿瘤增长、侵袭、转移及血管生成等肿瘤发生、发展的任何阶段［7］。TMPRSS4不仅激活ADAM受体系统和uPA/uPAR受体系统，还牵连、调节FAK、Src、Rac1、Akt、ERK、p38、JNK等诸多传导信号途径，通过启动ECM的降解来引发肿瘤的侵袭和转移［8-9］。

近期研究［10］证实，TMPRSS4在胃癌组织中的表达显著高于配对正常的癌旁组织，且在胃癌中的表达与TNM分期显著相关，TMPRSS4阳性组5年生存率显著低于TMPRSS4阴性组；在多变量统计分析中，发现TMPRSS4表达为胃癌预后的独立判定指标。此结论与本研究结果相一致。本研究选用相对正常胃黏膜、胃腺瘤、原发性胃癌及远处转移灶组织检测了TMPRSS4表达，发现随着疾病的进展（即正常黏膜、癌前病变、早期癌、进展癌、转移癌）TMPRSS4的表达呈递增趋势。

本研究选用“一患多比”，即同一患者的原发病灶与转移病灶间的TMPRSS4表达相互比较、原发病灶与相对正常胃黏膜间的TMPRSS4表达相互比较、转移病灶与正常胃黏膜间的TMPRSS4表达相互比较。本研究证实，肿瘤直径越大、淋巴脉管浸润越多、肿瘤浸润深度越深、淋巴结转移数目越多、远处转移部位越多TMPRSS4表达越高，而且其发生复发和转移概率会越高。

近期随着对TMPRSS4与肿瘤研究的深入，诸多研究方向的热点倾向通过阻断或抑制TMPRSS4活性来治疗各种恶性肿瘤。研究［11］发现，采用RNAi技术可抑制SW1990胰腺癌细胞的TMPRSS4表达，还能抑制TMPRSS4沉默细胞的侵袭和转移能力。TMPRSS4特异性人类抗体 （TMPRSS4 specific human antibody，TSHA；专利号：US 8501175 B2） 的研发，使得in vivo研究成果指日可待。这也是本研究组将要申报并完成的课题。

总之，TMPRSS4高表达可作为评估胃癌进展的新型生物学指标，具有肿瘤生物学特性的TMPRSS4可能参与肿瘤转移的调控。对TMPRSS4的进一步研究将为胃癌的诊治提供更加明确的思路与方向。