多靶点调控的整合医学模式探索治疗百草枯中毒的新途径

刘莹，张彧，李润玖

（大连医科大学附属第一医院急诊科，辽宁 大连 116011）

百草枯化学名称是1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，是一种快速灭生性除草剂，具有触杀作用和一定内吸作用，对人、畜具有非常大的毒性［1-3］。口服后可快速吸收，毒物吸收后引起肺出血、水肿、透明膜变性或纤维细胞增生，导致严重的难治性低氧血症，还可累及心、肝、肾、神经系统等，导致多器官功能衰竭，口服中毒后死亡率高达近90%［4-6］。

整合医学强调将医学各领域最先进的理论知识和临床各专科最有效的实践经验进行有机整合，是更加符合人体健康和疾病治疗的新医学体系。百草枯中毒同时存在多脏器功能障碍，救治中应运用整体观、整合观和医学观的原则，切实解决临床实践中遇到的问题。整合医学不仅仅是医学层面的整合，还是医学和科学前沿的整合，特别体现在医学和大数据的整合［7-8］。

由于目前缺乏特效解毒剂，口服百草枯中毒死亡率极高。能否利用已有药物靶点预测的相关数据库，系统分析百草枯的作用靶点，从多靶点调控的角度，以整合医学模式探索治疗百草枯中毒的新方法或新途径是研究重点。网络毒理学从药物、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发，采用复杂网络模型表达和分析研究对象的药理学性质，能够反映及阐释药物的多成分-多靶点作用关系，有望为药物作用机制研究等带来新突破。本研究拟从网络毒理学的角度，通过百草枯靶点基因网络的功能富集，探讨百草枯中毒的分子机制，为深入研究百草枯中毒的治疗方法和手段提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 靶点预测

1.1.1 方法一：毒性与基因比较数据库 （Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：//ctdbase.org/） 收集了化合物与基因、化合物与蛋白、化合物与疾病以及基因与疾病之间的相互作用。本研究使用 CTD数据库，以“paraquat”为关键词检索百草枯相关靶点。

1.1.2 方法二：SwissTargetPrediction （http：//www.swisst argetprediction.ch/） 是一个可精确预测生物活性分子靶点的服务器，这是根据已知配体的2D和3D相似性联合检测进行的预测。本研究运用SwissTargetPrediction服务器，以百草枯SMILES化学式“C ［N+］1=CC=C （C=C1） C2=CC=［N+］ （C=C2） C”为关键词检索百草枯相关靶点，点击submit即可预测相关靶点。

1.2 数据建立与整理

使用 Excel建立百草枯的基因数据集，分别纳入百草枯靶点基因，包括Gene Symbol、Gene ID、Interaction Count、Organism Count。

1.3 基因在线功能注释

基因本体 （Gene Ontology，GO） 数据库和京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 代谢通路数据库是目前最常用的基因功能注释数据库。GO数据库是2000年构建的一个结构化的标准生物学模型，涵盖了基因的细胞组分、分子功能、生物学过程。KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，把从已经完整测序的基因组中得到的基因目录与更高级别的细胞、物种和生态系统水平的系统功能关联起来。运用 DAVID （https：//david.ncifcrf.gov/） ，将预测的关键基因靶标进行GO注释和 KEGG 通路分析。

1.4 百草枯多成分-多靶点网络建立

把百草枯的靶基因根据Interaction count排序，筛选出Interaction count＞10的基因，将筛选后的靶基因输入STRING数据库 （https：//string-db.org/） ，选择人类复杂蛋白，物种为人类，得到靶点基因网络。

2 结果

2.1 百草枯的靶点预测

SwissTargetPrediction预测结果显示，百草枯的靶点包括多聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白 （PABPC） 、胆碱酯酶 （BCHE、ACHE） 、Muscleblind-like蛋白 （MBNL） 等，见图1。

CTD数据库预测结果显示，百草枯的靶点包括TNF、NFE2L2、TGFB1、CAT、CASP3等2 364个 基 因，根据Interaction count进行排序，表1列出了排名前10位的基因信息。将Interaction count＞10的67个基因输入到STRING数据库，构建的网络如图2所示。

2.2 网络富集分析结果GO分析

将百草枯预测获得的靶基因进行GO分析，如图3所示，百草枯的作用靶标主要涉及氧化应激反应、无机物质反应、凋亡、程序性死亡等过程。

2.3 网络富集分析结果KEGG通路分析

将百草枯预测获得的靶基因进行KEGG分析，如图4所示，KEGG 通路分析结果显示，涉及107条显著通路，主要为凋亡通路、Toll 样受体信号通路、NOD样受体通路等。

3 讨论

整合医学认为，维持机体康复的根本因素是机体整体及其微观各系统内部及系统间的稳定，这种稳定在宏观上通过机体的神经、内分泌、免疫3个系统的整体调节实现，而其微观上的物质基础则是分子水平上基因稳定表达［9］。本研究基于网络毒理学方法研究百草枯作用靶点，构建百草枯-多靶点网络，探究百草枯毒性作用的分子机制，为整合医学模式研究提供新思路，同时还可为百草枯中毒患者提供新的治疗方案，为多靶点调控的整合医学模式提供理论依据和循证医学证据。

图1 SwissTargetPrediction网站预测结果Fig.1 The prediction result of SwissTargetPrediction website

表1 排名前10位的百草枯预测靶点Tab.1 Top 10 predicted targets of paraquat

目前对于百草枯中毒机制研究［10-11］尚未形成定论，还有很多未知的机制可能发挥作用。本研究运用多种生物信息学方法构建出百草枯-靶点网络，在此基础上进行模式分析，得出百草枯作用通路图，初步解析了百草枯的物质基础和作用机制。CTD 是一个强大的、公开可用的数据库，旨在提高对环境变化如何影响人类健康的理解，它提供了许多可靠的信息，包括化合物-基因关系、化合物-疾病关系以及基因-疾病关系［12］。这些信息集成生物功能网络数据，可以帮助人们理解复杂疾病的发病机制，进一步对相关靶点进行 GO 注释和 KEGG 通路分析，揭示出百草枯中毒涉及氧化应激反应、无机物质反应、凋亡、程序性死亡等生物学过程，凋亡通路、Toll 样受体信号通路、NOD样受体通路等。

图2 百草枯的靶点基因网络Fig.2 Paraquat target gene network

图3 GO分析结果图Fig.3 Results of GO analysis

图4 KEGG分析结果图Fig.4 Results of KEGG analysis

目前，关于百草枯中毒得到最普遍认可的是活性氧造成肺损伤和纤维化［13-14］，可以简单理解为百草枯有着很强的氧化性，而肺纤维化就是对这种氧化损伤的一种保护措施。但这种保护措施也是一把双刃剑，一方面虽然缓解了百草枯造成的强烈氧化损伤，但是另一方面也会让肺气体交换功能逐渐丧失，被纤维化的肺泡细胞不具备气体交换功能。所以百草枯患者最终基本都是窒息而死，这是极其痛苦的一种死亡方式。通过本研究预测结果进行GO分析，发现百草枯的作用靶标涉及氧化应激反应，与文献报道一致；进一步进行文献调研，结果发现，胆碱酯酶、凋亡等靶点得到了相关文献［15-16］证实。上述文献验证结果表明，本研究预测得到的百草枯潜在作用靶点有较高的准确性，为进一步构建其多靶点网络奠定了基础。

本 研 究 整 合 了CTD、SwissTargetPrediction、GO、KEGG等多个数据库，建立了百草枯靶点作用网络。本研究仍存在一些不足，如百草枯靶点的筛选中，没有出现被广泛认同的炎症相关靶点，分析原因可能是采用的基因表达谱样本量少。后续研究中，将进一步增加研究样本，考虑百草枯入血成分含量的信息，构建权重网络，利用基因和蛋白等芯片技术对网络分析结果进行验证。

综上，本研究运用基因表达谱、药靶识别和网络毒理学技术探讨了百草枯中毒的分子机制，为同类研究提供了方法学参考。