参麦酒毒理学评价研究

徐清华，王娟，张凤清，*

（1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012；2.长春市产品质量监督检验院，吉林长春130012）

利用超高压提取技术提取人参的有效成分，乙醇回流法提取麦冬、肉桂、枸杞子，提取浸膏辅以蜂蜜制备了一款抗疲劳酒，拟申报具有缓解体力疲劳作用的保健酒。参麦酒中人参起主要作用[1-4]，人参被我国卫生部列为新资源食品[5]。超高压提取可以提高有效成分的提取率[6-8]。卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知（卫法监发[2002]51号）中规定，肉桂和枸杞子为药食两用品种，麦冬为我国保健食品可用品种。根据我国《保健食品备案与注册管理规定》的要求，保健食品申报必须进行毒理学安全性评价[9]，所以依据《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）对复方人参保健酒的急性毒性和遗传毒性进行了研究，以考察毒性级别和致突变作用，为注册检验提供技术支撑，同时也为保健食品的申报和技术审评提供基础研究资料。

1 材料和方法

1.1 受试物

参麦酒，规格：100 mL/（瓶·d）。60℃减压浓缩成20.83倍浓缩液作为本次试验受试样品，受试样品人体推荐剂量为4.80 mL/（人/d）。Ames试验、微核试验和小鼠精子畸形试验均使用样品20.83倍浓缩液。20.83倍浓缩液较稠，无法再度浓缩，高剂量组（人体推荐剂量100倍）采用酒基（50°）配制乙醇浓度无法调节到15%，故采用酒基（95°）调节各剂量组乙醇浓度至15%。

1.2 实验动物

急性经口毒性试验选用健康成年SPF级ICR小鼠20只，雌雄各半，动物体重雌性为19.1 g～20.9 g，雄性为19.5 g～20.9 g，由扬州大学比较医学中心提供，生产许可证号SCXK（苏）2012-0004，合格证编号：201612900。微核试验和小鼠精子畸形试验均选用南京医科大学医药实验动物中心繁殖的SPF级ICR健康小鼠，生产许可证号SCXK（苏）2016-0002。微核试验小鼠合格证编号：201616159；小鼠精子畸形试验小鼠合格证编号：201616161。

1.3 主要试剂与仪器

鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102：Molecular Toxicology，Inc.；大鼠肝 S-9 匀浆：江苏齐氏生物科技有限公司；DT-1000电子天平、JJ-100电子天平、AL104型电子天平：上海精密仪器仪表有限公司；显微镜：OLYMPUS；SG-603生物安全柜：美国BAKER；电热恒温培养箱、SX-700高压灭菌器、THZ-312型恒温摇床：常州首创仪器设备有限公司。

1.4 饲养条件

实验动物在温度为20.0℃～26.0℃、相对湿度为40%～70%的屏障系统中饲养。实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2015-0009。辐照灭菌饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，生产许可证：苏饲证（2014）01008。

1.5 试验方法

1.5.1 急性经口毒性试验

用最大耐受量法进行小鼠急性毒性试验，设计剂量为20 000 mg/kg bw。动物检疫3 d，试验前动物禁食16 d、自由饮水。样品用无菌水配制，最大配制浓度为1 000 mg/mL，按最大灌胃量20 mL/kg bw，一次给样，受试物给予剂量为20 000 mg/kg bw。给样后连续观察14 d，记录中毒表现及死亡情况。

1.5.2 Ames试验

采用标准平板掺入法，选鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株 TA97、TA98、TA100、TA102，经鉴定合格后进行试验。活化系统为β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S-9，S-9蛋白含量为30 mg/mL，其活力对2-氨基芴有良好的代谢激活能力。每100毫升S-9混合液中加10 mL S-9。阳性物：不加 S-9者为2，4，7-三硝基芴铜（TA97、TA98），甲基磺酸甲酯（TA100、TA102），加 S-9者为 2-氨基芴（TA97、TA98、TA100），1，8-二羟基蒽醌（TA102），同时设阴性对照组（未处理对照组和溶剂对照组）。在加与不加S-9混合液的情况下以5 000、1 000、200、40、8 μg/皿剂量进行试验，每个剂量组做3个平皿。样品置于0.103MPa条件下高温灭菌20min，在无菌条件下，称量受试样品并配制成溶液，受试样品用无菌水配制成50 mg/mL，即高剂量组，用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成 10、2、0.4、0.08 mg/mL 4个剂量组，加样量均为0.1 mL/皿。在2 mL顶层琼脂中加入0.1 mL试验菌株增菌液、0.1 mL受试样品溶液和0.5 mLS-9混合液（当需要代谢活化时）。混匀后倒入底层培养基平板上，37℃培养48 h，计数每皿回变菌落数。如果受试样品组的回变菌落数是阴性对照组回变菌落数2倍以上，并具有剂量-反应关系则为阳性。整个试验在相同条件下重复做一次。

1.5.3 小鼠骨髓细胞微核试验

选用体重25 g～30 g SPF级ICR小鼠60只，动物购买后适应环境3 d进行试验。按体重随机分为6个组，每组10只，雌雄各半。受试物人体推荐摄入量为：4.8 mL/（人/d）（体重按60 kg计），受试样品人的推荐摄入量的100倍为：8.0 mL/kg bw，最高剂量设为8 mL/kg bw，设 2、4、8 mL/kg bw 3 个剂量组、阴性对照组（包括空白对照组：无菌水10 mL/kg·bw灌胃、溶剂对照组：含15%乙醇的酒基10 mL/kg bw灌胃）、阳性对照组（环磷酰胺，40 mg/kg bw腹腔注射）。根据样品的溶解性选择95°基酒和无菌水配制，并调整各剂量组乙醇浓度为15%，低、中、高剂量组分别含受试样品浓度为20%、40%、80%，以10 mL/kg bw灌胃，采用30 h给受试物法。两次给受试样品间隔24 h，第二次给受试样品后6 h处死动物，取胸骨常规制片、镜检，每鼠计数1 000个骨髓嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计，结果采用U检验进行统计处理。每鼠计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（normochromatic erythrocyte，NCE），并计算嗜多染红细胞与成熟红细胞比值（PCE/NCE）。

1.5.4 小鼠精子畸形试验

选用体重25 g～35 g SPF级ICR性成熟雄性小鼠30只，动物购买后适应环境3 d进行试验。按体重随机分为6组，每组5只。设2、4、8 mL/kg bw 3个剂量组、阴性对照组（包括空白对照组：无菌水10 mL/kg bw灌胃、溶剂对照组：含15%乙醇的酒基10 mL/kg bw灌胃）、阳性对照组（环磷酰胺，40 mg/kg bw腹腔注射）。以10 mL/kg bw灌胃，每天1次，连续5 d。于首次给受试样品后的第35天处死动物，取两侧附睾精子滤液按常规制片、镜检。每鼠计数1 000个结构完整的精子，计算精子畸形发生率（以百分率计），结果采用秩和检验进行统计处理。

1.6 结果判定与统计

急性经口毒性试验根据急性毒性剂量分级表对该受试物进行分级。微核试验结果采用U检验进行统计处理，小鼠精子畸形试验结果采用秩和检验进行统计处理。

2 结果

2.1 急性经口毒性试验

参麦酒对小鼠体重和死亡数的影响见表1。

表1 参麦酒对小鼠急性经口毒性的影响（±s）Table 1 Effects of ginseng ophiopogon liquor on acute oral toxicity in mice（±s）

表1 参麦酒对小鼠急性经口毒性的影响（±s）Table 1 Effects of ginseng ophiopogon liquor on acute oral toxicity in mice（±s）

性别 动物只数MTD/（mg/kg bw）雌 10 20.3±0.6 27.4±1.1 20 000 0 ＞20 000雄 10 20.2±0.5 33.2±1.3 20 000 0 ＞20 000体重/g 终体重/g 剂量/（mg/kg bw）初始 死亡只数

试验观察期间，各组动物饮食和活动正常，生长良好，未见任何中毒表现及死亡。

2.2 Ames试验

参麦酒Ames试验回变菌落数见表2、表3。

表2 第一次参麦酒Ames试验回变菌落数（±s）Table 2 First time of ginseng ophiopogon liquor ames trial recall bacteria fall（±s）

表2 第一次参麦酒Ames试验回变菌落数（±s）Table 2 First time of ginseng ophiopogon liquor ames trial recall bacteria fall（±s）

注：**超过阴性对照组菌落数2倍以上。

-S-9 TA97 TA98 TA100 TA102 TA97 TA98 TA100 TA102自发回变 0 mL 119±11 36±5 156±22 269±25 119±12 35±6 164±14 271±17无菌水 0.1 mL 114±14 34±7 148±19 287±12 121±11 36±5 165±16 276±12参麦酒 8 μg 119±17 37±6 167±20 279±25 107±10 35±6 166±11 274±25 40 μg 115±12 36±6 148±17 260±22 107±14 38±7 173±26 279±20组别 剂量（以每皿计）回变菌落数+S-9 200 μg 117±15 38±5 154±15 277±20 117±12 38±6 174±15 270±31 1 000 μg 119±13 38±4 165±18 290±10 125±15 39±4 164±17 269±26 5 000 μg 117±14 38±4 157±12 267±25 110±13 33±4 182±14 277±31 2-氨基芴 10 μL 1 145±121**3 532±197**2 874±107**1，8-二羟基蒽醌 50 μL 1 235±184**2，4，7-三硝基芴铜 0.2 μL 2 741±122** 2 625±143**甲基磺酸甲酯 1.0 μL 2 743±217** 3 295±194**

表3 第二次参麦酒Ames试验回变菌落数（±s）Table 3 Second time of ginseng ophiopogon liquor ames trial count（±s）

表3 第二次参麦酒Ames试验回变菌落数（±s）Table 3 Second time of ginseng ophiopogon liquor ames trial count（±s）

注：**超过阴性对照组菌落数2倍以上。

-S-9 TA97 TA98 TA100 TA102 TA97 TA98 TA100 TA102自发回变 0 mL 112±16 38±4 184±10 283±25 117±16 38±6 176±21 271±16无菌水 0.1 mL 108±10 37±5 167±20 276±19 116±16 38±4 168±16 263±27参麦酒 8 μg 116±14 34±7 173±19 286±17 121±14 38±4 144±16 265±18 40 μg 116±11 38±5 175±18 272±22 120±13 36±6 148±17 287±14组别 剂量（以每皿计）回变菌落数+S-9 200 μg 120±18 37±4 161±22 253±12 122±16 36±5 160±16 257±12 1 000 μg 121±12 36±6 169±28 262±19 113±19 37±5 172±23 273±16 5 000 μg 111±13 36±7 174±21 268±20 109±19 34±4 187±13 273±29 2-氨基芴 10 μL 1 218±182**3 367±163**2 680±177**1，8-二羟基蒽醌 50 μL 1 265±108**2，4，7-三硝基芴铜 0.2 μL 2 717±80** 2 645±132**甲基磺酸甲酯 1.0 μL 2 383±172**3 427±151**

受试样品溶液、溶剂对照、缓冲液以及S9混合物在无菌平板上均未观察到受污染的菌落。各剂量组回变菌落数均未超过阴性对照组回变菌落数的2倍，亦无剂量-反应关系。即参麦酒对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株试验菌株，在加与不加S-9时，均未见有致基因突变作用。

2.3 小鼠骨髓细胞微核试验

参麦酒对小鼠骨髓细胞微核发生率和嗜多染红细胞与成熟红细胞比值（PCE/NCE）的影响见表4。

表4 参麦酒对小鼠骨髓细胞微核发生率和嗜多染红细胞与成熟红细胞比值（PCE/NCE）的影响Table 4 Effect of ginseng ophiopogon liquor on the incidence of micronucleus and the ratio of polychromatic erythrocyte to mature red blood cell（PCE/NCE）in bone marrow cells of mice

由表4可见，各剂量组微核率与阴性对照组比较无显著性差异（P＞0.05），而阳性对照组高于阴性对照组，有显著性差异（P＜0.05）。受试物各剂量组的嗜多染红细胞与成熟红细胞比值（PCE/NCE）与对照组的差异均在对照组20%以内，受试物对骨髓细胞增殖没有抑制作用。未见参麦抗疲劳酒对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成及嗜多染红细胞与成熟红细胞比值（PCE/NCE）产生影响。

2.4 小鼠精子畸形试验

参麦酒对小鼠精子畸形率的影响见表5。参麦酒对小鼠精子畸形类型及比例的影响见表6。

表5 参麦酒对小鼠精子畸形率的影响Table 5 Effect of ginseng ophiopogon liquor on sperm abnormality of mice

表6 参麦酒对小鼠精子畸形类型及比例的影响Table 6 Effect of ginseng ophiopogon liquor on type and proportion of sperm abnormalities in mice

由表5、表6可见，各剂量组精子畸形率与阴性对照组比较，无显著性差异（P＞0.05），而阳性对照组小鼠精子畸形率高于阴性对照组，有显著差异（P＜0.05）。因此参麦酒对小鼠精子畸形率未产生影响。

3 结论与讨论

《保健食品检验与评价技术规范》2003版规定了保健食品安全性毒理学评价的4个阶段和内容，按照不同保健食品选择毒性试验的原则要求，本实验受试物有一个原料是新资源食品，两个原料可药食两用，一个原料可以用做保健食品原料，故应该进行第一阶段和第二阶段的毒理学安全性评价。第一阶段小鼠最大耐受剂量（maximumtolerateddose，MTD）20000mg/kgbw，大于15 g/kg，按食品急性毒性剂量分级标准判断，受试物属于无毒。通过致突变实验可以对受试物的遗传毒性进行考察，遗传毒性的试验组合应该综合考虑原核细胞和真核细胞、生殖细胞和体细胞、体内试验和体外试验相结合的原则，本研究选用了Ames试验（细菌致突变试验）、小鼠骨髓细胞微核实验、小鼠精子畸形实验作为第二阶段遗传毒性检测。结果，3项试验试验结果为阴性。表明本实验条件下本受试物无遗传毒性。

相关文献报道了人参、肉桂、麦冬、枸杞子单味药材的毒性研究[10-19]。参麦酒无急性毒性和遗传毒性，与其中单味药的文献报道一致。

朱薇薇[20]以高粱酒、海狸鼠肝（獭肝）、枸杞、制首鸟、蜂蜜、肉桂、甘草、山艾肉、龙眼肉、人参、牡蛎、丁香、海狸鼠鞭（獭鞭）为主要原料制成了三栋健酒，并对其进行安全性毒理学试验，结果未观察到有毒副作用。洪丽华等[21]研究参杞红玛胶囊的急性毒性和遗传毒性，参杞红玛胶囊由人参、枸杞、红景天、玛卡、淫羊藿等组成，在实验条件下，参杞红玛胶囊属无毒级，未见遗传毒性。人参、肉桂、麦冬、枸杞子四味药材加以蜂蜜制成酒剂联合毒性作用未见报道。本研究证实了参麦酒属无毒级，未显示致突变作用。研究结果为参麦酒注册检验提供实验依据，同时为保健食品申报提供毒理学基础研究。