响应面法优化酵子生产工艺研究

孙祥祥，刘长虹，*，张萌，王远辉，张煌

（1.河南工业大学，小麦和玉米深加工国家工程实验室，河南郑州450001；2.河南牧业经济学院食品与生物工程学院，河南郑州450044）

酵子作为传统的面食发酵剂，在中国传统的主食馒头制作过程中起到不可或缺的作用[1]。由于酵子是一种多菌种面食发酵剂，并含有大量酵母中不具有的产脂霉菌、产香霉菌和多种细菌等可增加馒头风味的菌种，使得蒸制的馒头风味独特，香甜可口[2-3]，得到老百姓的喜欢。虽然酵子出现很早，但是发展比较缓慢，制作工艺粗放，发酵条件不稳定，生产效率低，酵子品质不稳定，制约了酵子工业化生产[4-5]。如果采用工业化技术生产传统口味馒头，既可以大大提高面粉的附加值，也可产生可观的经济效益[6]。

响应面法能同时对多因子水平及其交互作用进行评价和预测，并能快速有效地确定多因子系统的最优条件[7]。本文以成酵子馒头比容、硬度及感官品质为指标，在单因素试验的基础上，进行Box-Behnken试验设计，对酵子制作所需的米酒、小曲、大曲添加量3个因素进行响应面优化试验分析，旨在为酵子制作或批量生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

特一粉：郑州金苑面业有限公司；高活性干酵母（低糖）：安琪酵母股份有限公司；蒸馏水：由蒸馏水仪器制得的Ⅲ级水；早籼稻米：安徽合肥；大曲：市售；小曲：苏州粮油食品有限公司；糯米：湖北龙赛湖粮油食品有限公司；米酒：小麦与玉米深加工国家工程实验室自制。

1.2 仪器与设备

SZH-20双速双动和面机：广州旭众食品机械有限公司；BS600L电子天平：上海友声衡器厂；101A-3型电热鼓风干燥箱：上海市实验仪器总厂；DZF型真空干燥箱：北京市永光明医疗仪器有限公司；WFX-12-15-24-0豪华型雾化面食发酵箱：中山市丰盛电器厂；DS-671电子秤：上海寺岗电子有限公司；JBDZ-20白度仪：上海嘉定粮油仪器有限公司；硬度仪：小麦与玉米深加工国家工程实验室自制。

1.3 试验方法

1.3.1 米酒制作

糯米/水1∶1（g/mL）→浸泡（12 h）→过滤→蒸制（45 min）→冷却（30℃）→1.6%小曲碾磨后溶解在蒸馏水中，与蒸熟糯米搅拌均匀，密封→恒温（26℃）发酵48 h→米酒

（各配料比例均以第一次添加糯米总质量为基准）

1.3.2 酵子制作

米酒、大曲、米粉、小曲、375%温水（30℃）混合均匀→发酵3 h→补加米粉200%，搅拌均匀成稠糊，发酵12 h→补加625%米粉、125%温水，揉成面团，发酵3 h，成泡沫状→补加83%米粉，搅拌均匀，发酵2 h→拍饼，25℃鼓风干燥48 h

（各配料比例均以第一次添加米粉总质量为基准）

1.3.3 馒头制作

馒头的制作工艺流程如下：面粉、酵子、酵母、水→和面→压面→成型→醒发→蒸制→成品

将面粉、酵子3%、酵母0.2%、水45%加入和面机，先低速搅拌2 min，再高速搅拌10 min；自动压面20次；手工成型；在温度为35℃、相对湿度为85%的条件下醒发60 min；用电蒸锅蒸25 min。

1.3.4 酵子制作单因素试验设计

在前期确定的工艺参数基础上，研究酵子制作所需的米酒添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、小曲添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、大曲添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%），考察各单因素制作酵子对馒头感官品质的影响。

1.3.5 响应面优化

选取米酒添加量（A）、小曲添加量（B）、大曲添加量（C）3个因素进行响应面优化，以Y（馒头感官评分）为考核指标，确定最佳制作工艺条件。试验因素水平表见表1。

表1 响应面优化试验因素水平表Table 1 Response surface optimization experiment factor level table

1.3.6 馒头白度的测定

采用白度仪测定馒头白度[8]。

1.3.7 馒头硬度的测定

采用自制硬度仪测定馒头硬度[9]。

1.3.8 馒头感官评价

馒头感官评分采用感官评价[10]的方法，并略加修改，选5名经过培训的评价员集体评分（见表2）。

表2 馒头感官评价表Table 2 Sensory evaluation form of steamed bread

1.4 数据分析

使用单向方差分析（ANOVA），使用SPSS 24.0软件进行统计分析。使用Duncan检验，P＜0.05为有统计学意义。采用EXCEL 2016作图。采用Design Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken Design试验设计。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 不同米酒添加量制作酵子对馒头品质的影响

在大曲添加量为0.5%、小曲添加量为2%的条件下，研究米酒添加量制作酵子对馒头品质的影响。不同米酒添加量制作酵子对馒头白度、硬度的影响结果见图1。

图1 不同米酒添加量制作酵子对馒头白度、硬度的影响Fig.1 Effect of the amount of rice wine added on the whiteness and hardness of steamed bread

米酒中富含多种氨基酸及葡萄糖、麦芽糖、低聚糖等，以及适量的有机酸、酒精、维生素[11-12]。酵子制作加入米酒的目的除提供微生物源和风味物质外，还为微生物提供主要的能源物质[13]。由图1可以看出，随着米酒添加量的增加，制作的酵子，蒸制出来的馒头的白度先升高后降低再略有增加，硬度呈现先降低后升高再略有降低的趋势。制作的酵子馒头的硬度与白度呈现对称关系。当米酒添加量为8%时，制作的酵子馒头的白度显著高于其他米酒添加量的酵子（P＜0.05），而硬度显著低于其他米酒添加量的酵子（P＜0.05）。添加米酒量较少所制作的酵子，制作的馒头的硬度较大，内部结构与口感较差，气味较弱。可能由于米酒量少，酵子里面的菌群所需的营养物质也相对减少，菌群的生长也受到了抑制，使得酵子中菌群变少，产气变弱，产生脂类、醇类、醛类等物质量也相对减少，影响到馒头的气味与品质。米酒添加量制作酵子对馒头感官评价的影响见图2。

由图2可以看出，当米酒添加量为8%时，制作的酵子，蒸制出来的馒头的感官评分最高，为80.8分，显著高于其他条件的米酒变量的酵子制作的馒头（P＜0.05）。这与米酒添加量为8%制作酵子对馒头的硬度，白度的结果一致。米酒的添加，发挥的是多种微生物的共生优势，主要作用机理是根霉、酵母和细菌等几种主要微生物的酸化、糖化、酒化、酯化等过程的协同进行，形成醇、酯、醛、酚等多种风味物质，米酒发酵的微生物群落组成直接影响米酒的风味[14-15]，进而影响到酵子馒头的风味。

图2 不同米酒添加量制作酵子对馒头感官评价的影响Fig.2 Effect of making rice wine on the sensory evaluation of steamed bread

2.1.2 不同小曲添加量制作酵子对馒头品质的影响

在大曲添加量为0.5%、米酒添加量为8%的条件下，研究不同小曲添加量制作酵子对馒头品质的影响。

小曲又叫白药、酒饼、白曲、酒药、药曲、糠曲、酒曲丸等[16]。不同小曲添加量制作酵子对馒头白度、硬度的影响结果见图3。

图3 不同小曲添加量制作酵子对馒头白度、硬度的影响Fig.3 Effect of xiaoqu addition on the whiteness and hardness of steamed bread

由图3可以看出，小曲添加量在1%～2%，制作的酵子馒头的硬度明显降低，白度明显升高。小曲添加量为2%～3%时，酵子馒头硬度与白度几乎没有变化。小曲添加量为3%～5%时，酵子馒头的白度呈现先降低后升高的趋势，硬度先升高后降低。小曲添加量为2%～3%时，制作的酵子馒头的白度显著高于其他小曲添加量的酵子（P＜0.05），而硬度显著低于其他小曲添加量的酵子（P＜0.05）。小曲中的微生物主要是霉菌和酵母菌，还有一些细菌和放线菌[17]，小曲制作中添加适量的中药可以促进霉菌、酵母菌有益菌种生长繁殖和酶的代谢，同时可以抑制杂菌生长[18]，酵子制作中添加小曲，蒸制出来的馒头有淡淡的酒香味。小曲添加量制作酵子对馒头感官评价的影响见图4。

图4 不同小曲添加量制作酵子对馒头感官评价的影响Fig.4 Effect of xiaoqu addition on making sensory evaluation of steamed bread

由图4可以看出，小曲添加量为2%时，馒头的感官评分高于其他小曲添加量的酵子制作的馒头。

2.1.3 不同大曲添加量制作酵子对馒头品质的影响

在小曲曲添加量为2%、米酒添加量为8%的条件下，研究不同大曲添加量制作的酵子对馒头品质的影响。大曲中的微生物主要源自原料、水、空气、场所和谷壳、稻草等所携带的微生物，也有在制作过程中加入少量曲母以强化菌株，通过自然培养、富集等过程，进而形成大曲的独特微生物菌系[19]，其中酵母菌是大曲主要的功能微生物之一[20]。大曲添加量制作酵子对馒头白度、硬度的影响见图5。

图5 不同大曲添加量制作酵子对馒头白度、硬度的影响Fig.5 Effect of daqu addition on whiteness and hardness of steamed bread

由图5可以看出，当大曲添加量为0.5%时，制作的酵子，蒸制出来的馒头的硬度显著低于其他条件的大曲添加量的酵子所制作的馒头（P＜0.05）。当大曲添加量为0.9%时，制作的酵子，蒸制出来的馒头的白度显著高于其他条件的大曲添加量的酵子所制作的馒头（P＜0.05）。大曲添加量制作酵子对馒头感官评价的影响见图6。

图6 不同大曲添加量制作酵子对馒头感官评价的影响Fig.6 Effect of daqu addition on making sensory evaluation of steamed bread

由图6可以看出，随着大曲添加量的增加，馒头的感官评分先增加后降低，当大曲量为0.5%，制作的酵子，蒸制出来的馒头的感官评价显著高于其他条件的大曲添加量的酵子所制作的馒头（P＜0.05）。综合考虑，大曲的添加量为0.5%时，制作的酵子品质较好。

2.2 响应面分析法优化酵子制作工艺结果分析

2.2.1 结果分析

在单因素试验分析的基础上，依据Box-Behnken中心组合试验设计三因素三水平共17个试验，响应面试验结果见表3。

表3 Box-Behnken中心组合试验设计及结果Table 3 Box-Behnken center combination test design and results

通过表3试验值的二次多元回归拟合，得到感官总分（Y）响应3变量的二次多项式型：Y=80.54-4.70A-1.15B+0.45C-0.90AB-0.050AC-0.50BC-4.19A2-1.25B2+0.1C2，对此二次回归方程进行方差分析，结果见表4。

表4 响应面设计二阶回归模型方差分析Table 4 Response surface design second-order regression model analysis of variance

从表4可知，模型的失拟项P=0.064 1＞0.05，说明回归模型与实际试验拟合较好，试验误差小；模型P＜0.000 1，说明该二次回归方程拟合度好，方程能够正确反映酵子馒头感官总分与各因素之间的关系。模型的相关系数R2=0.974 7，说明预测值与试验值有较高相关性；调整决定系数R2Adj=0.942 2，说明方程模型可信度较高，能够较好地描述试验结果。因此，该二次回归方程正确反映了米酒、小曲、大曲添加量对酵子制作，所蒸制馒头感官总分的影响。

根据表4，响应面设计二阶回归模型方差进行分析，因素F值的大小可以反映出其对试验指标的重要性，F值越大，表明对试验指标影响越大，即重要性越大[21]。所以，影响酵子因素主次排列顺序为：米酒添加量＞小曲添加量＞大曲添加量。在本次试验建立的模型中米酒添加量的一次项、二次项对制作酵子，所蒸制的馒头的感官评分影响极显著（P＜0.01）；小曲添加量的一次项、二次项对制作酵子，所蒸制的馒头的感官评分影响显著（P＜0.05）。而大曲一次项、米酒与小曲交互项、米酒与大曲交互项、小曲与大曲交互项、大曲二次项对感官评分影响不显著。由此可知，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系[22]。

应用Design-Expert软件对上述试验结果进行响应面分析，可以得到该模型的响应面图和等高线图，结果如图7～图9所示。

图7 米酒变量与小曲变量响应面及等高线图Fig.7 The response surface and contour plots of rice wine variables and xiaoqu variables

图8 米酒变量与大曲变量响应面及等高线图Fig.8 The response surface and contour map of rice wine variant and daqu variable

图9 小曲变量与大曲变量响应面及等高线图Fig.9 The response surface and contour map of xiaoqu variable and daqu variable

等高线的形状可以反映因素间交互作用的强弱，圆形表示交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著[23]。通过Design-Expert软件对试验模型进行优化，以感官评分最高为目标，最高分为82.7分，得到最佳工艺为米酒量为6.97%、小曲量为1.52%、大曲量为0.70%。

3 结论

通过对米酒、小曲、大曲添加量3个因素进行优化试验，利用响应面法优化酵子生产工艺。依据Box-Behnken中心组合试验设计得到二次回归方程：Y=80.54-4.70A-1.15B+0.45C-0.90AB-0.050AC-0.50BC-4.19A2-1.25B2+0.1C2，R2=0.974 7，方程拟合良好。优化试验确定的最佳工艺条件为：米酒量为6.97%、小曲量为1.52%、大曲量为0.70%。在此条件下预期的制作酵子馒头的感官总分是82.7分，实际得分为81.5±0.4分。