裱花蛋糕中8种合成色素的高效液相色谱检测

周霞，王延华，张玲玲，孙芬芳，王霞

（青岛农业大学海都学院食品系，山东莱阳265200）

随着生活节奏的加快，快餐类食品越来越频繁的走上人们的餐桌。简单快捷的蛋糕类食品因其优美的造型、艳丽的色彩和香甜的口味受到上班族以及儿童的青睐，成为他们的下午茶甚至早餐的重要组成部分。然而蛋糕类食品尤其是裱花蛋糕为了美观，在制作过程中往往需要添加着色剂（又称食用色素，简称色素）。着色剂主要包括人工合成色素和天然色素两类。人工合成色素与天然色素相比，具有成本相对低廉、化学结构稳定、受热稳定性强、容易着色等特点而被广泛应用[1]。研究表明，过量摄入合成色素，影响儿童智力发育，干扰儿童正常代谢功能，并且可能在体内蓄积并分解转化成致癌物质[2]。GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中对合成色素在食品中的使用范围和限量做了明确的规定[3]。

目前，食品中合成色素的检测方法主要有高效液相色谱法[4-8]、高效液相色谱-质谱连用法[9]、气相色谱-质谱联用法[10]，另外微柱法[11]、导数伏安法[12]、极谱法[13]、静电离子色谱法[14]、毛细管电泳法[15]、分光光度法[16-17]等也有报道。高效液相色谱法因其简单、高效、成本低廉而受到人们的青睐。食品安全国家标准GB 5009.35-2016《食品安全国家标食品中合成着色剂的测定》对果汁饮料、蜜饯类及着色糖衣制品中7种合成色素的提取和测定做了详细的描述。但该方法涉及到的色素种类和样品种类有限，复杂基质食品中合成色素的简单、准确、快速提取测定仍需作进一步研究。为此，学者们做了很多有益的尝试[18-21]。裱花蛋糕中合成色素的测定目前鲜有报道。裱花蛋糕基质复杂，蛋白质和油脂含量高，按照GB 5009.35-2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》规定的方法进行前处理，提取率和重现性均不能得到很好的保证。本文通过改进样品前处理方法和色谱条件，为裱花蛋糕中合成色素含量测定提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（色谱纯，使用前过滤、脱气）：瑞典欧普森化工有限公司；乙酸铵（优级纯，配制成浓度为0.02 mol/L的溶液并过滤、脱气）：百灵威化学科技有限公司；乙酸锌（配制成浓度为21.9%的水溶液备用）、亚铁氰化钾（配制成浓度为10.6%的水溶液备用）、无水乙醇、氨水、柠檬酸（配制成20%的水溶液备用）（均为分析纯）、聚酰胺粉（100目～200目）：国药集团工业有限公司；柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红、新红：国家标准物质研究中心；聚酰胺小柱（2 g，12 mL）：美国安捷伦科技有限公司；试验用水均为超纯水（电阻率18.3 MΩ/cm2）；裱花蛋糕：市售。

1.2 仪器与设备

Ultimate3000高效液相色谱仪（配紫外检测器、自动进样器）：美国赛默飞世尔公司；YKTD-360W超声波清洗机：北京亚科天达科技公司；TDL-5000BR台式冷冻离心机、LAB DANCER涡旋振荡器：德国艾卡集团；DC-24-RT水浴型氮吹仪：上海安谱实验科技有限公司；XS104电子分析天平：德国梅特勒-托利多集团；FJ200-SH高速分散均质机：上海沪析实验有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

Syncronis C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；柱温 30℃；流速 0.5 mL/min；进样量 20 μL；紫外检测器，检测波长254 nm；流动相：甲醇和乙酸铵（0.02 mol/L，20%柠檬酸调pH=4.0），梯度洗脱，流动相梯度洗脱程序如表1所示。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Elution condition of synthetic pigments by HPLC

1.3.2 标准曲线

分别准确移取浓度均为1 mg/mL的柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红和浓度为0.1 mg/mL 的新红标准品各 0.10、0.25、0.5、0.75、1.0 mL于5个10 mL容量瓶中，用现制的一级水定容至刻度，摇匀，配成新红浓度为 1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/mL，其他标准品浓度为 10、25、50、75、100 μg/mL 的混合标准溶液，用0.22 μm的针式过滤器过滤，按照色谱条件进行检测，根据峰面积和对应的浓度制作标准曲线。

1.3.3 样品处理

将完整的裱花蛋糕切碎，均质机匀浆混匀，称取2 g（精确至0.01g）样品于离心管中，加入石油醚10mL，超声振荡2 min，弃去石油醚层。加入21.9%乙酸锌和10.6%亚铁氰化钾各2 mL，振荡摇匀，加入乙醇-氨水（7∶3，体积比）混合溶液5 mL，涡旋混匀，超声振荡5 min，5 000 r/min离心5 min，收集上清液。将残渣继续用5 mL乙醇-氨水重复提取，直至残渣无色。合并上清液，水浴浓缩至10 mL，待净化。

用甲醇和水各5 mL活化聚酰胺小柱，重复3次。将浓缩后的提取液用20%柠檬酸调节pH值至6.0左右，上柱。上样完成后，先用甲酸-甲醇（4∶6，体积比）混合液3 mL淋洗3次，然后用水洗至流出液为中性，弃去流出液。最后用10 mL乙醇-氨水（7∶3，体积比）混合洗脱液洗脱小柱至无色，将洗脱液合并，水浴蒸发至近干，然后用水定容至，经0.22 μm针式过滤器过滤，在仪器工作条件下进行测定。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 样品的预处理

裱花蛋糕基质复杂，含有大量的脂肪和蛋白质，干扰后续操作，必须预先除去。目标物8种色素都是水溶性的，不溶于油脂，试验采用石油醚萃取以除去脂肪，效果良好，对色素的回收率影响可以忽略。由于蛋白质吸附色素，试验采用21.9%乙酸锌和10.6%亚铁氰化钾溶液使蛋白质沉淀的同时，加入提取剂提取色素，在超声波的强力振荡下，裹夹在蛋白中的色素被释放进入提取剂中。

2.1.2 净化条件的优化

采用聚酰胺固相萃取小柱对提取液进行净化，并与聚酰胺粉吸附法进行比较。聚酰胺粉吸附法对操作温度要求较高（60℃），所需淋洗液和洗脱液体积大，色素回收率尤其是赤藓红回收率偏低（78%）。因此，对于含赤藓红的样品，GB 5009.35-2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》中采用液-液分配法进行处理。液-液分配法使用大量有机溶剂，操作繁琐，试验结果受操作条件影响较大，不利于批量处理。试验聚酰胺粉吸附法和聚酰胺柱固相萃取法两种净化方法对合成色素回收率的影响，结果如表2所示。

结果表明，聚酰胺柱固相萃取法操作程序简洁，溶剂使用量较小，8种色素的回收率均明显提高。

2.2 色谱条件的优化

以甲醇和乙酸铵（0.02 mol/L，20%柠檬酸调pH=4.0）为流动相进行梯度洗脱，试验了流速为0.3、0.5、1.0 mL/min时8种合成色素的分离情况。流速为1.0 mL/min时，分析时间较短，但仪器的柱压增高，柱效也明显降低，柠檬黄和苋菜红没有达到基线分离。在0.3 mL/min流速下，分析时间延长，峰展宽严重。流动相流速为0.5 mL/min时，8种色素分离良好，峰形尖锐，分析效果好，分析时间适中。综合出峰时间、色素分离效果、仪器柱压等因素，最终确定0.5 mL/min为最佳流速。在最佳流速下，对比了柱温为20、25、30、35℃时目标物质的分离情况。结果表明，4个温度下8种色素均能达到基线分离。鉴于柱温大于室温时，环境对柱温影响较小，温度波动小，所以选择30℃为测定柱温。色谱条件优化后8种合成色素的色谱图如图1所示。

表2 合成色素在两种净化方法下回收率比较Table 2 Recovery comparison of synthetic pigment between two purification methods

图1 8种合成色素混合标准溶液色图谱Fig.1 Chromatogram of the mixed solution of eight kinds of synthetic pigments

2.3 分析方法评价

2.3.1 方法检出限及线性回归方程

将配制好的标准溶液上机检测，以相应的峰面积为纵坐标、标准溶液的浓度为横坐标作标准曲线，计算回归方程和相关系数。以逐渐减少标准溶液添加量的方法进行试验，用色谱峰面积是极限噪音的3倍计算检出限。试验结果如表3所示。

从表3中可以看出，用本试验方法对8种合成色素进行分离分析的线性范围较宽，线性良好，检出限较低，能够满足裱花蛋糕中合成色素检测要求。

2.3.2 样品中8种合成色素的加标回收率和精密度

选取空白裱花蛋糕样品，添加不同水平的8种合成色素，按试验方法制备样品溶液，在最佳色谱条件下平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差，结果如表4所示。

表3 8种合成色素的线性回归方程、相关系数和检出限Table 3 Linear relationship，correlation coefficient and limit of detection of eight synthetic pigments

表4 样品加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 4 Recovery and relative standard deviation for the 8 synthetic pigments in spiked sample（n=6）

由表4可以看出，8种合成色素的加标回收率为83.1%～99.7%，相对标准偏差为0.767%～7.943%，回收率和精密度良好。

2.3.3 样品溶液稳定性试验

将提取净化后的净化液放入冰箱-4℃冷藏，每1、4、8、12、24、48、168 小时将样品取出，恒温至室温后上机检测，比较放置时间对样品溶液中目标物质的影响。结果表明，样品溶液在冰箱-4℃冷藏放置一周，各色素出峰时间无明显变化，色谱峰重现性良好，说明样品溶液在-4℃冷藏的条件下一周时间内不影响试验结果，本方法适合于批量样品的处理检测。

2.4 样品测定

利用优化后的样品前处理方法和色谱测定条件，测试了莱阳常见品牌不同类型、不同尺寸12批裱花蛋糕中8种合成色素的含量，样品类型涉及奶油裱花蛋糕、巧克力裱花蛋糕、水果裱花蛋糕，样品外观上包含色彩艳丽的和纯奶油色2种。其中样品11为奶油色裱花蛋糕，样品12有红色和黄色装饰，其余10个样品均有艳丽的外观。裱花蛋糕中合成色素的测定结果见表5。

表5 裱花蛋糕中合成色素的测定结果Table 5 The determination results of synthetic pigments in different samples

由表5可知，样品11、12未检测出目标物质，其余10个样品均不同程度的检出合成色素。样品11没有艳丽的外观，应该不含合成色素，所以没有检出；样品12外观艳丽但未检出目标物质，推测其使用了天然色素，有待进一步确认。其他样品外观艳丽，均检出了不同种类、不同含量的合成色素。GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中对糕点上彩装中8种合成色素的限量规定分别是新红0.05 g/kg、柠檬黄0.1 g/kg、苋菜红0.05 g/kg、胭脂红 0.05 g/kg、日落黄 0.1 g/kg、诱惑红 0.05 g/kg、亮蓝 0.025 g/kg、赤藓红0.05 g/kg。

从表5中可以看出，检测样品均未超标使用色素，但不同样品色素含量及种类差别较大。

3 结论

1）在超声波振荡作用下，利用石油醚除油脂、乙酸锌、亚铁氰化钾沉淀蛋白联合乙醇氨水混合溶液提取，聚酰胺固相萃取小柱净化，高效液相色谱法分离检测，实现了裱花蛋糕中的8种合成色素新红、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红的高效、快速、准确测定。

2）通过对实际样品的测定，可以得知裱花蛋糕中合成色素主要来源于裱花过程中的人为添加。对于没有艳丽颜色的纯奶油色裱花蛋糕，没有必要添加色素，相对更健康。由于不同花色对颜色需求不同，导致蛋糕中合成色素的含量差别比较大。市售蛋糕中有使用天然色素调色的，但比例偏低，需要相关部门进行适当的引导和监督。

3）本试验处理样品时将蛋糕胚和奶油一同均质测定，使得测定结果偏低，均没有超出最大使用限量。如果有消费者更喜爱吃裱花蛋糕上的装饰奶油，不吃蛋糕胚，则本试验结果不能作为参考。裱花蛋糕上的装饰奶油中的合成色素含量有待进一步研究。