茶叶儿茶素及咖啡碱检测方法中提取条件研究

涂云飞

（1.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江杭州310016；2.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州310016）

儿茶素是以2-苯基苯并吡喃为主体结构的黄烷醇类化合物，一般包括表型儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子型儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG），其总质量份数在干茶中一般高于7%（质量分数）。儿茶素具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等特性[1-17]，是茶叶重要的风味与保健因子。

茶叶中儿茶素及咖啡碱可以通过丙酮、乙醇、甲醇、乙腈或水等为溶剂在一定温度与时间参数条件下提取出来。利用纯水在80℃提取20 min，可将97%的儿茶素提取出，提高温度至95℃提取10 min，能够获得90%的提取率，但高温长时间可使儿茶素类成分降解[18]与异构化[19-21]。茶儿茶素的提取还受到pH的影响，随其值增加，茶四种主要儿茶素破坏也增加[22]，即茶儿茶素在碱性条件下极其不稳定，降低pH至4以下会使其更加稳定，同时维生素C能够在中性溶液中显著增加儿茶素结构的稳定性[23]。另有研究采用70%甲醇溶液3次提取，并用水定容到50 mL[24]或0.1 g样品加入体积分数为50%的甲醇水溶液10 mL，置于超声波中超声提取40 min[25]均可作为茶儿茶素有效检测的前处理提取方法。

同时，绿茶中咖啡碱的含量在2%～5%（质量分数）左右，具有兴奋中枢神经系统，促进胃酸分泌、治疗偏头痛[26]，但不适宜易失眠者、小孩、孕妇以及老人饮用。故准确的定量这两类成分为衡量茶叶品质、指导绿茶加工等领域的应用作出重要的技术保障。国际、国家执行标准[Determination of substances characteristic of green and black tea-Part 2：Content of catechins in green tea-Method using high-performance liquid chromatography（ISO14502-2005E），茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法（GB/T 8313-2008）][27-28]已经给出了茶叶中4种表型儿茶素及（+）-儿茶素的高效液相色谱的检测方法，并以70%甲醇作为溶剂提取茶叶中的茶儿茶素，茶儿茶素可以看作茶叶品质等级的重要指标。现有标准GB/T 8313-2008中，甲醇作为儿茶素及咖啡碱的提取试剂具有较高的挥发性和毒性，寻找安全低毒类试剂作为提取试剂具有一定的意义。笔者将茶有效成分提取工艺生产中广泛采用的水和乙醇，引入到茶叶儿茶素及咖啡碱的定量提取当中，并考察优化了提取参数。

1 材料与方法

1.1 仪器

JB/T5374型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HH-6型水浴锅：常州朗越仪器制造有限公司；TDZ4A-WS离心机：湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；Waters高效液相色谱仪（1525泵、2487紫外可见双通道检测器、717-plus自动进样器、Breeze控制软件包，色谱柱为Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl，250mm×4.6mm，5μm，柱温为35℃，检测波长为278nm，进样量10 μL）：沃特世科技（上海）有限公司。

1.2 试剂

乙醇（分析纯，纯度≥99.7%）：浙江三鹰化学试剂有限公司；乙腈、冰醋酸、甲醇（分析纯，纯度≥99.5%）：国药集团化学试剂有限公司；纯净水：浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室自制。

1.3 茶样

选用两只粉碎60目以上的绿茶样（绿茶1号样和2号样为浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室自制）作为实验对象，并以国标（GB/T 8313-2008）方法对两只绿茶样中的没食子酸（GA）、表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（（+）-C）、咖啡碱（CAF）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）作了测定，见图1。

具体结果为：绿茶1号和2号样中GA、EGC、（+）-C、CAF、EC、EGCG、ECG 质量百分含量（%，质量分数）分别为 0.07、0.28、0.13、2.96、0.60、8.82、2.32；0.14、0.56、0.07、4.29、0.26、9.03、3.04。

1.4 正交试验设计

准确称取0.2 g茶样至100 mL提取三角瓶中，加入30 mL溶剂，振荡提取一定时间后，3 000 r/min心10 min，上清转入50 mL容量瓶中，待冷却至室温用去离子水定容至刻度，摇匀备用。并以乙醇浓度、提取温度、提取时间作了三因素三水平优化试验，具体试验安排如表1所示。

图1 没食子酸、咖啡碱及儿茶素测定色谱图Fig.1 HPLC spectrum of GA，caffeine and catechins

表1 三因素三水平正交试验安排表Table 1Factors and levels of L9（33）orthogonal design

2 结果与讨论

2.1L9（33）正交试验结果与方差分析

正交试验各因素极差值可直观判断其对茶叶中被检成分提取时的影响程度，即因素对试验无影响时，因素各水平对应的k值应相等。L9（33）正交试验结果与方差分析见表2。

表2 三因素三水平正交试验结果与方差分析Table 2Results of extraction method L9（33）orthogonal design and variance analysis

由表2极差分析可知，3个因素对 GA、EGC、（+）-C的影响较为显著，极差值占k值的10%以上。提取时间与提取温度对EC无影响，对CAF、EGCG及ECG的影响较小；乙醇浓度对CAF的影响较小，但对EGCG和ECG达到了显著水平，即随着乙醇浓度的增加，EGCG和ECG在提取液中的浓度亦随之加大。GA、EGC、（+）-C由于本身在茶叶中的含量相对较低，虽然各因素有影响，但是不同水平条件下均可较充分的提取出来。

续表2 三因素三水平正交试验结果与方差分析Continue table 2Results of extraction method L9（33）orthogonal design and variance analysis

为辨别因素与试验误差对各成分检测试验数据波动的贡献程度，试验进一步对结果进行了方差分析检验，并将各因素的方差小于2倍误差方差合并至误差项，以提高F检验的灵敏度。结果表明，（1）在0.05置信水平，提取温度对GA达到极显著水平，对EGC达到显著水平，乙醇浓度对CAF达到显著水平；（2）在0.01置信水平，乙醇浓度对EC、EGCG、ECG达到极显著水平，提取温度对EC的影响达到极显著水平，对EGCG达到显著水平。而各因素对GA、（+）-C的影响，方差分析未达到显著水平。

进一步分析发现，100℃会造成酯型儿茶素类成分发生部分降解，适度的温度有利于儿茶素类成分的提取和稳定。极显著因素乙醇20%浓度在70℃条件下，GA、EGC、（+）-C、CAF 及 EC 在 10 min～30 min 均得到了充分提取；而酯型儿茶素EGCG和ECG相比于国标方法（GB/T 8313-2008），约有百分之十几的含量未被提取出来。

2.2 单因素乙醇浓度对酯型儿茶素浸出影响

试验在2.1的基础上，增加了乙醇浓度，考察了乙醇浓度对酯型儿茶素的浸出情况见图2。

图2表明，当浓度提高至25%及30%时，酯型儿茶素在10 min～30 min能完全提取浸出，即，1号样与2号样酯型儿茶素EGCG的浸出率分别为96.64%～100.01%和100.00%～132.51%；ECG的浸出率分别是国标方法的96.36%～100.95%和97.85%～104.36%。因此在一定温度的前提下，浓度与浸出高度相关，但过高的浓度会提高酯溶性成分的浸出，增加色谱柱污染程度，因此，在充分提取各成分条件前提下，乙醇浓度25%～30%适合作为茶叶中儿茶素及咖啡碱定量的提取溶剂。

图2 乙醇浓度及提取时间对酯型儿茶素提取的影响Fig.2 Influence of ethanol concentration and infusion time factors on galloyl catechins leaching rate

3 结论

本文将安全低毒类试剂乙醇水溶液引入到茶叶儿茶素及咖啡碱的定量提取当中，并考察优化了提取参数。在正交试验各因素水平范围内，GA、EGC、（+）-C、CAF及EC能充分提取，但酯型儿茶素未能充分提取。3个因素当中，发现乙醇浓度对EGCG和ECG的提取率均达到极显著水平，因此，笔者进一步在单因素的基础上将其当浓度提高至25%及30%两个浓度时，各茶样的酯型儿茶素在10 min～30 min能完全提取浸出。为避免过高乙醇浓度增加茶酯溶性成分的溶出，控制乙醇浓度在水中的浓度范围25%～30%时，固液比 1∶250（g/mL）、70℃的水浴和 10 min～30 min的提取时间能够满足茶叶中儿茶素及咖啡碱的定量提取分析。