玉龙贴膏质量标准研究

刘东文，何宝凝 ，陈韵姿，陈淑映，李怀国

（广东省佛山市中医院制剂中心，广东 佛山 528000）

温经玉龙散是佛山市中医院骨科的临床验方，由赤芍、肉桂、生草乌、白芷、干姜等组方，能温经散寒、活血止痛，主要用于跌打旧患、寒邪着络引起的关节酸痛或外科关节痛等症，临床已使用近50年，疗效确切[1－3]。但由于使用时要加水、蜜糖等煮成糊状再敷于患处，并用绷带固定，导致使用不便，且使关节活动受限。为满足临床用药需要，本研究中拟以温经玉龙散为配方，以热熔压敏胶为基质研制出新的贴膏剂玉龙贴膏。热熔压敏胶是继溶剂型和乳液型压敏胶之后的第3代压敏胶产品，以热塑性聚合物为主体成分，兼有热熔和压敏双重特性，为近年经皮给药系统研究的热点[4]。方中生草乌所含乌头碱既是有效成分，又是毒性成分，因此严格控制其含量十分必要。本研究中对方中主要药味进行了定性、定量研究，可为质量标准的制订和临床安全用药提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 1525型高效液相色谱仪，2996型紫外检测器（美国Waters公司）；CPA225D型十万分之一电子天平（赛多利斯公司）；KQ－300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DT5－1型低速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）。

1.2 试药

玉龙贴膏（医院自制制剂，批号分别为3081603，3081604，3081605，规格为每片 9 cm）；芍药苷对照品（批号为 110736－201438），桂皮醛对照品（批号为110710－201217），乌头碱对照品（批号为 110720－201111），均由中国食品药品检定研究院提供。预制硅胶G薄层板（德国默克公司）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 制备方法

取赤芍、肉桂、生草乌、白芷、干姜等药材，粉碎成细粉，过筛，混匀，加入融化成液态的热熔压敏胶和适量辅料，搅拌均匀，涂布，冷却，切片，制成1 000片，即得，每片含赤芍、生草乌的生药量均为0.84 g，含肉桂生药量为0.42 g。

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1 赤芍

取本品2片，除去盖衬，剪成小块，加乙醇80 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例及制法，以淀粉代替赤芍制成不含赤芍的阴性样品，取2片，按供试品溶液制备方法制成缺赤芍的阴性对照品溶液。照2015年版《中国药典（四部）》通则中薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（40 ∶5 ∶10 ∶0.2）为展开剂[5]158，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。结果见图1 A。

2.2.2 肉桂

取本品1片，除去盖衬，剪成小块，加乙醇10 mL，冷浸30 min，时时振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1 mL含1 μL的溶液，作为对照品溶液。按处方比例及制法，以淀粉代替肉桂制成不含肉桂的阴性样品，取1片，按供试品溶液制备方法制成缺肉桂的阴性对照品溶液。照2015年版《中国药典（四部）》通则中薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和缺肉桂的阴性对照品溶液各5 μL，对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）－乙酸乙酯（17 ∶3）为展开剂[5]137，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。结果见图1 B。

2.3 芍药苷含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：XTerra RP18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 －0.05 mol／L 磷酸二氢钾溶液（38 ∶62）；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL ／min；进样量：10 μL。理论板数以芍药苷峰计应不低于3 000。

2.3.2 溶液制备

图1 薄层色谱图

取同一批（批号为3081603）样品10片，除去盖衬，精密称定，剪碎，混匀，取相当于1片的质量，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，再用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含芍药苷0.515 0 g／L的溶液，作为对照品溶液。按处方比例取除赤芍外的其余成分制成缺赤芍的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取2.3.2项下3种溶液各10 μL，按拟订色谱条件测定，记录色谱图，详见图2。结果在与对照品溶液相应位置上，供试品溶液有色谱峰，阴性对照品溶液无色谱峰，表明阴性对照无干扰。

线性关系考察：精密吸取芍药苷对照品溶液1，2，5，10，15，20 μL，按拟订色谱条件测定，以峰面积（Y）对芍药苷进样量（X）进行回归，得线性方程 Y＝1.55×106X＋2.38×105，r＝0.999 2（n＝6）。结果表明，芍药苷进样量在0.515～10.300 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，重复进样6次，测定。结果芍药苷峰面积的 RSD为0.46%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为3081603）样品6份，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，测定含量。结果芍药苷平均含量为每片0.027 7 g，RSD为0.57%（n＝6），表明方法重复性良好。

图2 芍药苷高效液相色谱图

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于 0，4，8，12，18，24 h时进样，依法测定，记录峰面积。结果的RSD为1.02%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为3081603）6份，分别精密加入芍药苷对照品，依法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 芍药苷加样回收试验结果（n＝6）

2.3.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，进样测定。结果批号为3081603，3081604，3081605的样品中每片平均含量分别为 0.027 7，0.027 5，0.026 4 g，RSD 分别为0.57%，0.61%，0.51% （n＝3）。

2.4 乌头碱限量检查

2.4.1 色谱条件

色谱柱：XTerra RP18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 －0.1%三乙胺（70 ∶30）；检测波长：235 nm；流速：1.0 mL ／min；进样量：10 μL。理论板数以乌头碱峰计应不低于3 000。

2.4.2 溶液制备

取同一批（批号为3081603）号的样品10片，除去盖衬，精密称定，剪碎，混匀，取相当于1片的质量，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水20 mL，静置5 min，再加乙醚 50 mL，冷浸 24 h，转移至离心管中，在 3 000 r／min的转速离心 5 min，取乙醚层，沉淀用乙醚洗涤5次，每次20 mL，合并乙醚液，低温（＜40℃）挥干，残渣精密加甲醇5 mL溶解，密塞，摇匀，再用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。取乌头碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成含乌头碱0.301 2 g／L的溶液，作为对照品溶液。按处方比例取除生草乌外的其余成分制成缺生草乌的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.4.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取2.4.2项下3种溶液各10 μL，按拟订色谱条件测定，记录色谱图，详见图3。结果在与对照品溶液色谱相应位置上，供试品溶液有色谱峰，阴性对照品溶液无色谱峰，表明阴性对照无干扰。

图3 乌头碱高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取乌头碱对照品原液1.0，2.0，3.0，5.0 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，连同乌头碱对照品原液按拟订色谱条件进行测定，以峰面积（Y）对乌头碱质量浓度（X）进行回归，得线性方程 Y＝ 4.61×104X－5.53×105，r＝0.999 0（n＝4）。结果表明，乌头碱进样量在0.301 2～3.012 0 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取质量浓度为0.301 2 g／L的乌头碱对照品溶液，重复进样6次，测定。结果乌头碱峰面积的 RSD为0.87%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为3081603）样品6份，按2.4.2项下方法制备供试品溶液，测定含量。结果乌头碱平均含量为每片 0.451 8 mg，RSD为 1.27% （n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，因乌头碱溶液不稳定，故存放于冰箱中，分别于 0，2，4，8，12 h 时各进样 10 μL，记录峰面积。结果的 RSD为0.93%（n＝5），表明供试品溶液在12 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为3081603）6份，分别精密加入乌头碱对照品，依法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 乌头碱加样回收试验结果（n＝6）

2.4.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，进样测定。结果批号为3081603，3081604，3081605的样品中，乌头碱每片平均含量分别为 0.451 8，0.445 7，0.455 2 mg，RSD 分别为 1.27%，1.14%，1.36% （n＝3）。

3 讨论

玉龙贴膏为新型的中药橡胶膏剂，具有组成复杂、主药含量少和基质难于去除的特点。基质与待测成分分离是橡胶膏剂含量测定的关键，在制订质量标准时要考虑所选成分的代表性及测定方法的可行性。赤芍是方中主药，其主要有效成分为芍药苷，因此选择芍药苷的含量作为一个质控指标。比较了芍药苷多个提取方法[无水乙醇回流提取、50%乙醇回流提取[6]、甲醇回流提取[7]和甲醇回流提取后过柱[8]]，比较了提取时间 20，40，60 min，结果发现50%乙醇回流提取60 min提取率最高。因此，采用该方法作为本品芍药苷的含量测定方法。根据2015年版《中国药典（一部）》赤芍饮片项下规定含芍药苷不得少于1.5%，按理论计算本品每片含芍药苷应不得少于0.012 6 g。本研究中对玉龙贴膏3批次的样品进行芍药苷的含量测定，结果均符合规定。

草乌为国家规定的28种有毒中药材之一，为保证制剂产品质量和临床安全用药，必须严格控制其使用量，而《中国药典》并未对生草乌外用作出限量规定。参考原卫生部药典委员会《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》标准，含草乌的外用制剂只有一个制剂品种，即乌头酊，乌头碱的限量规定为0.045%～0.055% （g ／mL）[9]。因此，玉龙贴膏含乌头碱应为每片0.378～0.462 mg。本研究中对玉龙贴膏3批次的样品进行乌头碱的限量检查，结果均符合规定。

乌头碱的提取方法有多种，氨乙醚冷浸、氨乙醚超声提取、酸提氯仿萃取、酸提乙醚萃取[10]等，经比较后选取提取效率较高的氨乙醚冷浸法。在流动相比例选择上，曾采用甲醇 －0.2%三乙胺（66∶34）、甲醇－0.2%三乙胺（60∶40），但分离效果不理想，最后选用甲醇－0.1%三乙胺（70∶30）为流动相，分离效果好。采用高效液相色谱法测定乌头碱的含量，准确，可靠，较薄层色谱法能更准确地反映药品的毒性水平，可更好地指导生产，为临床安全用药提供依据。