固相微萃取-气相色谱/质谱结合化学计量学方法分析四种茶油的挥发性成分

钟培培， 喻 晴， 王远兴

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047)

油茶籽油俗称茶油，它是从山茶科山茶属植物的普通油茶(CamelliaoleiferaAbel)成熟种子中提取的纯天然高级食用植物油，属我国特有的木本食用油脂。茶油中富含多种功能性成分，营养丰富，具有调节血脂，降低胆固醇含量，预防心脑血管疾病，延缓动脉粥样硬化等功效[1]。精制茶油是粗制茶油经过一系列的脱胶、脱酸、脱色、脱臭等生产工艺加工制成，而粗制茶油颜色较深，气味较丰富。外用山茶油主要用于外用护肤，不宜食用。茶油放置时间过久会发生变质，从而失去原有的营养价值。

固相微萃取(SPME)是一种新型无溶剂样品前处理技术，一般在2～30 min内可达吸附平衡[2]，已广泛应用于油脂挥发物质的分析。通过气相色谱/质谱(GC/MS)检测多个样本后所得到的样品信息具有数据信息复杂、多维数据矩阵内各变量之间具有高度的相关性等特点，常常无法用传统的单变量分析方法进行提取，但与多元统计分析手段结合后可以确定样本之间的相似性或均一性。其中，主成分分析方法可以高分辨、高效率地确定引起组间差异的化学成分[3]；聚类分析是以“物以类聚”的原理,根据所测样品的诸多属性,按照所测样品性质的亲疏远近程度而进行分类的一种多元统计学分析方法[4]。本文采用SPME技术提取4种茶油中的挥发性物质，通过GC/MS与保留指数对其中的挥发性成分进行鉴定，并采用主成分分析和聚类分析技术比较4种茶油挥发性物质的成分差异，为茶油的质量鉴别与品质控制提供了有效的检测方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器、材料与试剂

7890-7000气相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪(美国，Agilent公司)，配有Mass Hunter Workstation色谱工作站和NIST MS Search 2.0质谱检索数据库；57330-U SPME手柄及50/30 μm二乙烯基苯-碳分子筛-聚二甲基硅氧烷(DVB-CAR-PDMS，Stable flex)固相微萃取纤维头(美国，SUPELCO公司)；AL104电子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)。

从市场上采集精制茶油、粗制茶油、外用茶油及过期茶油(储存时间超过保质期1年以上)4种茶油样本，其中精制茶油与粗制茶油各7个样本，外用茶油及过期茶油各8个样本，4种茶油于4 ℃冰箱中存放。

正构烷烃(C7～C30)的混合标准品(色谱纯，美国AccuStandard公司)；正己烷(色谱纯，德国Merck公司)。

1.2 样品前处理

称取6.00 g茶油样品于20 mL顶空萃取瓶中，将顶空萃取瓶置于80 ℃水浴锅中平衡20 min，再将固相萃取头插入顶空萃取瓶中，萃取吸附50 min。萃取结束后将萃取头放入GC/MS进样口中，于250 ℃解析5 min后，进行GC/MS测定。

1.3 色谱-质谱条件

色谱柱：HP-5 MS石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：起始柱温30 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至110 ℃，然后以4 ℃/min升至150 ℃，最后以10 ℃/min升至220 ℃保持5 min；载气为高纯氦气(纯度≥99.999%)；流速为1 mL/min；进样口温度250 ℃；分流比为2∶1。电子轰击离子源(EI)；电子能量70 eV；四极杆温度为150 ℃，离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；溶剂延迟为3 min；质量扫描为全扫描模式，质量范围m/z30～500。

1.4 茶油挥发性成分保留指数(Retention Index,RI)的测定

取正构烷烃混合标准品，按照1.3条件进行GC/MS分析，进样量1 μL，分流比为10∶1，记录每种正构烷烃标准品出峰的保留时间，采用Kovats保留指数(Retention Index,RI)来计算各组分的RI值:

RI=100n+100(TRx-TRn)/(TRn+1-TRn)

(1)

式中：RI为待测组分的保留指数；TRx为待测组分的保留时间；n和n+1 分别表示正构烷烃的碳原子数；其中TRn

1.5 数据处理

根据NIST MS Search 2.0质谱图库检索结果，并结合保留指数参考文献值对4种茶油的挥发性成分进行初步筛查鉴定，并运用峰面积归一化法测得各挥发性成分的相对百分含量。以样本挥发性物质的相对峰面积为变量，将数据导入SIMCA-P 13.0版软件，将数据标准化后进行主成分分析和聚类分析。

2 结果与讨论

2.1 茶油的挥发性成分的定性分析

经过GC/MS检测后，根据NIST MS Search 2.0质谱图库检索结果，结合保留指数文献值对精制、粗制、外用及过期茶油中的共同成分进行了初步鉴定，结果详见表1。由表1可知，4种茶油共初步鉴别出81种挥发性成分，精制茶油中共同含有31种挥发性成分，包括11种醛类(47.7%)，4种酮类(1.55%)，1种醇类(1.58%)、3种烯烃类(4.97%)，8种烷烃类(39.99%)，1种呋喃类(1.89%)，1种芳香烃(0.78%)、1种酸(0.26%)，一种单帖(1.26%)，其中十二烷(21.23%)、壬醛(18.48%)、己醛(8.4%)、反式-2-庚烯醛(5.71%)含量较高；在粗制茶油中共同含有43种挥发性成分，包括12种醛类(60.54%)、2种酮类(4.41%)、1种醇(1.01%)、6种酚类(4.32%)、4种烷烃类(4.94%)、4种烯烃类(1.57%)、1种呋喃(0.94%)、3种芳香烃(8.49%)、7种酯(4.44%)、1种萘(0.11%)，1种胺(4.5%)，其中(反，反)-2，4-癸二烯醛(16.15%)、壬醛(10.91%)、4-乙基愈创木酚(2.12%)含量较高；外用茶油各样品共同含有33种挥发性成分，包括14种醛类(85%)，5种酮类(5.16%)，3种醇类(3.86%)，1种酸酐(0.64%)，3种烷烃类(0.27%)，4种烯烃类(2.59%)，2种呋喃(0.44%)，其中反式-2-十一烯醛(13.76%)，反式-2-癸烯醛(24.7%)，壬醛(14.45%)，己醛(11.41%)含量较高；过期茶油各样品共同含有50种挥发性成分，19种醛类(75.13%)、9种酮类(4.64%)、6种醇类(6.99%)、1种酸酐(4.65%)、3种烷烃类(0.6%)、3种烯烃类(2.14%)、3种酯(0.68%)、1种呋喃(2.14%)、3种酸(0.42%)、2种芳香烃(2.62%)，其中己醛(13.06%)，(反，反)-2，4-癸二烯醛(10.87%)，反式-2-十一烯醛(9.73%)，反式-2-癸烯醛(9.29%)，反式-2-辛烯醛(9.18%)相对含量较高。从中可以看出精制茶油中烷烃和醛类相对含量较高，粗制茶油中醛类、芳香烃、酚类成分的相对含量较高，过期茶油中的醛类、醇类成分相对含量较高，外用茶油中的醛类和酮类成分相对含量最高。四种茶油样品中共同含有己醛、庚醛、3-乙烯基-环己酮、3-丙基环己烯、反式-2-庚烯醛、2-戊基呋喃、反-2-辛烯醛、反式-3-辛二烯-2-酮、壬醛、癸醛、反式-2-癸烯醛、茴香脑、(反，反)-2，4-癸二烯醛、反式-2-十一烯醛、十四烷等挥发性成分。

表1 4种茶油挥发性成分定性分析结果

(续表1)

No.tRCompoundMolecular formulaRetention indexRIexpRIlitIdentificationRelative content(%)RefinedCrudeExternal usingExpired5623.3755-Butyldihydro-2(3H)-FuranoneC8H14O212621277MS,RI-0.83-0.125723.470(E)-2-DecenalC10H18O12651267[5]MS,RI3.947.8224.79.295823.571-Oxaspiro[4.5]decan-2-oneC9H14O21269-MS--1.740.635923.8102,6-Dimethyl-5,7-octadi-en-3-olC10H18O1276-MS---0.460244-EthylguaiacolC9H12O212811280[17]MS,RI-2.12--6124.442Cis-AnetholC10H12O12961293[5]MS,RI0.787.791.872.566224.581TridecaneC13H2813011300MS,RI0.40.13--6324.9342-MethylnaphthaleneC11H1013121289MS,RI-0.11--6425.143(E,E)-2,4-DecadienalC10H16O13191322[5]MS,RI1.6516.154.0310.876525.244α-2-Dimethyl-1-cyclo-hexene-1-acetaldehydeC10H16O1323-MS---0.046625.9134,4,6-Trimethyl-cyclohex-2-en-1-ol C9H16O1251-MS-1.012.573.146726.2222,6-Dimethoxy-phenolC8H10O313551347MS,RI-0.94--6826.3865-AllylguaiacolC10H12O213581360MS,RI-0.08--6926.513(E)-2-UndecenalC11H20O13671369[5]MS,RI1.99.8313.769.737026.967Fumaric acid,decyl 3-methylbut-3-enyl esterC19H32O41383-MS---0.447127.561TetradecaneC14H3014001400MS,RI8.122.220.170.217229.998CyclopentadecaneC15H3014831480[18]MS,RI1.41---7330.1121-PentadeceneC15H3014871491MS,RI0.570.12--7430.693EremophileneC15H2415091514MS,RI--2.14-7532.959HexadecaneC16H3416011600MS,RI1.260.590.06-7634.380Oleic acidC18H34O21680-MS---0.077734.74HeptadecaneC17H3617001700MS,RI--0.04-7835.851OctadecanolC18H38O1778-MS1.58---7935.946(Z)-13-Eicosenoic acidC20H38O21784-MS0.26---8038.497Ethyl palmitateC18H36O219961995[17]MS,RI-0.2--8139.905Methyl oleateC19H36O221042100[19]MS,RI-0.35--

Note：tR:retention time；RIexp:Retention index for detection；RIlit:Retention index for literature.

图1 4种典型茶油样本的挥发性成分的总离子流图 Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile components in four typical camellia oils the serial number(1-81) of volatile competents are the same as those table 1.

图2 4种茶油12个样本的挥发性成分纵向叠加总离子流色谱图Fig.2 Total ion current chromatograms of volatile components in 12 camellia oil samples stacked by vertical pattern

茶油风味清淡，多数风味化合物为油脂内部分解产生，醛类风味阀值一般较低，对油脂风味有突出贡献。其中，己醛、庚醛和2-戊基呋喃为亚油酸的氧化裂解产物，壬醛和辛醛为油酸的氧化裂解产物。己醛具有强烈的青香、木香、草香、蔬菜、水果香气，庚醛具有类似甜杏、坚果香气，2-戊基呋喃具有豆香、果香、泥土、青香及类似蔬菜香气，壬醛具有蜡香、甜桔香、脂肪香、花香，辛醛高浓度有粗油脂味，低浓度呈甜橙、轻微油脂、蜂蜜样香气[5]。过期茶油中的哈喇气味是由普通茶油油脂的氧化酸败生成的一些小分子的醛、酮、醇而产生的[20]，所以过期茶油中的醛、酮、醇类等成分含量高于其它3种茶油。粗制茶油中的酚类物质含量高于精制茶油，是因为茶油在碱炼过程中大量酚类物质遭到破坏，而且茶油在精炼过程中还会损失一部分挥发性成分，所以粗制茶油的成分较为复杂，气味比精制茶油丰富。精制茶油与外用茶油的加工方式不同，用途不同，也就导致了挥发性成分之间存在差异。

4种茶油的典型总离子流图色谱见图1(各峰编号同表1)。不同种类的茶油其挥发性成分及其含量会有差别，同一种类不同的茶油样品由于地域、生产时间、生产机器等因素的不同其各挥发性成分组成及含量也会存在较大差别。图1是从各类茶油中选取的比较典型的样本，可以看出4种茶油成分复杂，在本实验中所采用的色谱-质谱条件能较好的将其中的挥发性成分进行分离。图2是4种茶油其中的12个样本挥发性成分纵向叠加总离子流色谱图。

2.2 主成分分析

利用SIMCA-P 13.0软件对4种茶油样品挥发性成分的相对含量进行主成分分析，由结果可知，第一主成分的贡献率为33.9%，第二主成分的贡献率为21.3%，第三主成分的贡献率为13.3%，第四主成分的贡献率为5.37%，第五主成分的贡献率为3.1%，第六主成分贡献率为2.66%，累积贡献率为79.6%，足以说明数据的变化趋势。图3为4种茶油的主成分二维得分图和二维载荷图。

从图3(A)可以看出4种茶油在主成分空间中的分布较为分散，且均处于相对独立的空间，基本得到有效区分，说明四种茶油的挥发性成分存在明显的差异。由图3(B)可以看出，不同的变量对茶油的区分模型的建立和贡献是不同的。图3(A)得分图表示各种样品基于挥发性成分含量的相似性和差异性，图3(B)则能比较明显的看出区分这些样品的关键变量。其中癸烷(19)、柠檬烯(23)、2-壬酮(34)、十一烷(36)、3-甲基十一烷(45)、十三烷(62)、环15烷(72)、十六烷(75)、十八醇(78)、5-十八碳烯醛(79)等挥发性成分在载荷图中的位置与得分图中精制茶油的位置类似，说明这些成分在精制茶油中较其它种类油高。三乙胺(1)、苯乙烯(5)、间乙基甲苯(31)、愈创木酚(33)、3-甲基-2-丁烯酸十七烷基酯(42)、甘菊蓝(46)、反式-2-甲基巴豆酸异戊酯(49)、2-己烯酸乙酯(55)、2-甲基萘(63)、2，6-二甲氧基苯酚(67)、5-丁香酚(68)、4-乙基愈创木酚(60)、棕榈酸乙酯(80)、油酸甲酯(81)等挥发性成分在载荷图中的位置与得分图中粗制茶油的位置类似，其在粗制茶油中的含量较高。反式-3-壬烯-2-酮(40)、壬烷(8)、反式-2-戊烯醛(3)、己醛(4)、正辛醛(20)、反式-2，4-庚二烯(22)、正己酸(24)、3，5-辛二烯-2-醇(25)、桃醛(27)、反式-2-辛烯醛(28)、己酸酐(29)、2，5-二甲基环己醇(35)、(反，反)-2，4-辛二烯醛(38)、17-十八炔酸(47)、癸醛(51)、1-氧杂螺[4.5]癸-2-酮(58)、2，6-二甲基-5，7-辛二烯-2-醇(59)、油酸(76)等挥发性物质的载荷图与得分图中过期茶油所处的位置类似，所以在过期茶油中这些挥发性成分的含量高于其它种类油。3-乙烯基环己酮(10)、反式-2，4-庚二烯醛(18)、2-正丙基呋喃(21)、(反，反)-3-辛二烯-2-酮(32)、茴香脑(61)、佛术烯(74)、十七烷(77)等挥发性成分在载荷图中的位置与得分图中外用茶油所处的位置类似，所以这些成分在过期茶油中的含量较高。

图4 4种茶油的聚类分析树状图Fig.4 Cluster dendrogram of 4 types of camellia oils

2.3 聚类分析

图4为4种茶油样本的聚类分析图，其中纵坐标代表类间距离，而横坐标代表茶油的样本编号。临界值λ=590时，茶油样本分为两大类，过期茶油(15～22)聚为一类，其余三种茶油聚为一类，临界值λ=490时，茶油样本分为三类，过期茶油与粗制茶油(8～14)各聚为一类，外用茶油(23～30)与精制茶油(1～7)聚为一类，临界值λ=350时，茶油样本分为四类，四种茶油各聚为一类。聚类分析图直观地显示了整个聚类过程，缩小了凭借主观判断造成的误差。聚类分析结果表明，不同种类的茶油具有明显的内在差异，精制茶油与外用茶油挥发性成分的差异程度最小，其次是粗制茶油，精制茶油与过期茶油挥发性成分差别最大。由此可见，采用聚类分析可将不同种类的茶油得以较好的聚类。

3 结论

本实验通过SPME-GC/MS结合化学计量学方法对4种不同种类的茶油挥发性成分进行了研究。结果显示，4种茶油共鉴定出81种挥发性成分，其中醛类在4种茶油中的含量最高，是构成茶油香气的主要成分。利用主成分分析方法提取了6个主成分，累计贡献率达到79.6%，从主成分得分图中可直观看出不同种类茶油间的差异，从载荷图中可以明显找出区分不同种类茶油的差异成分。利用聚类分析可以看出各种茶油之间的亲疏远近，其中精制茶油与外用茶油的挥发性成分最为接近。SPME-GC/MS结合化学计量学方法能够实现不同种类茶油或其它品种油的区分，并筛选出其中的差异成分，也可用于茶油的产地判别研究，为茶油的质量鉴别与品质控制提供了有效的检测方法。