应用原代软骨细胞与SW1353软骨肉瘤细胞系建立体外骨关节炎模型的效果评价

刘晓彤，黄悦，刘旭丹，徐小磊，姜梦琪，杨迎春，何健宜，顾海伦，刘莉*

（1中国医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，沈阳 110100；2中国医科大学附属盛京医院骨科，沈阳 110004）

骨关节炎（osteoarthritlis，OA）又称退行性骨关节病，以关节软骨退变及继发性骨质增生为主要特征[1]，在人群中的发病率及致残率均较高[2]。OA的危险因素主要包括年龄、性别、肥胖、关节损伤等[3]，但其具体发病机制仍不十分清楚，且无有效的根治方法。关节软骨的变化被认为是OA发生发展过程中最主要的病理过程[4]，软骨细胞是关节软骨的唯一细胞成分，其合成分泌的II型胶原及蛋白多糖是组成软骨细胞外基质的主要成分，且在维持软骨功能方面发挥决定作用。研究表明，OA时软骨细胞基质减少、功能衰退[5]。因此，对于软骨细胞的研究是探讨OA的发病机制、寻找有效防治措施的必要手段。

软骨细胞体外培养是了解软骨细胞生物学性状的重要方法[6]。目前，针对OA的体外实验研究大多采用原代细胞或细胞系来进行[7,8]，如正常软骨细胞、OA软骨细胞或软骨肉瘤细胞系（如SW1353细胞系）等。但以上细胞在作为OA体外实验研究对象时，细胞的病理变化及对炎症的反应程度存在一定的差异。因此，本研究通过比较白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）处理下，来源于OA患者的原代软骨细胞及SW1353软骨肉瘤细胞系的增殖活力、OA的炎症标志性产物白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）及基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13 ，MMP-13）表达水平、炎症反应信号通路的核因子 -κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表达水平的异同，建立与评估不同来源的体外OA模型，为OA的体外实验研究中细胞的选择提供理论依据。

材料与方法

1 原代软骨细胞及SW1353软骨肉瘤细胞系的培养

取 8例因 OA 行膝、髋关节置换的患者关节软骨组织（男 4 例、女 4 例，患者年龄 32～81岁，经某三甲医院医学伦理委员会批准、患者知情同意），采用胰酶（0.25 %）、Ⅱ型胶原（0.08 %）两步消化，200目筛网过滤分离，培养关节原代软骨细胞，并进行传代培养，至第3代使用；SW1353细胞系购置于中国科学院上海生科院细胞资源中心。均使用低糖DMEM培养基（10% FBS、1% 青链霉素），于37℃、5 % CO2、饱和湿度培养箱中培养。

2 主要仪器与试剂

主要仪器：超净工作台（成都市苏净科学器材有限公司）；细胞培养箱（上海科峻仪器公司）；倒置显微镜（日本OlymPus 公司）；Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo公司）； 7500 Real-Time PCR仪（美国ABI公司）

主要试剂：IL-1β（美国PeProTech）；DMEM（美国Hyclone）；FBS（美国CLERK）；Ⅱ型胶原酶（美国Invitrogen）；胰蛋白酶（美国GIBCO）；Ⅱ型胶原一抗（中国博士德）；SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Trizol（大连宝生物工程有限公司）；CCK-8（日本东仁）；ELISA 试剂盒（中国博士德）；PCR扩增试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。

3 原代软骨细胞爬片及表型鉴定

第2代关节原代软骨细胞融合至80%～90%，消化传代至预先放入无菌盖玻片的直径为35mm的培养皿中，37℃，5% CO2细胞培养箱中培养，待细胞约融合50%左右，进行表型鉴定。Ⅱ型胶原检测（免疫细胞化学法）：细胞用4%多聚甲醛室温固定20min；3% H2O2孵育10min；正常山羊血清室温孵育15min，一抗4℃过夜；辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育15min；H2O2-DAB 呈色，苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树胶封片。蛋白多糖检测（甲苯胺兰染色法）：细胞用4%多聚甲醛室温固定20min，1% 甲苯胺蓝染色30min，梯度酒精脱水，中性树胶封片。

4 CCK-8法检测细胞增殖活力

取对数生长期细胞，胰酶（0.25%）消化后制备单细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl（约含细胞数2000个）。原代细胞分组如下：对照组（CON组）、IL-1β（10ng/ml）组，分别处理24h、48h及72h；SW1353细胞分组如下：CON组、IL-1β（1、10、20、40ng/ml）组，处理24h。酶标仪490nm波长处测量OD值。

5 IL-6、MMP-13 水平和 NF-κB mRNA 表达检测

取对数生长期细胞接种于6孔板，待融合至80%～90%后，加药处理，分组如下：CON组、IL-1β（10ng/ml）组。收集细胞及细胞培养上清，-80℃保存待测。IL-6、MMP-13水平的ELISA法测定：根据ELISA说明书按步骤进行。

NF-κB mRNA表达水平的Real-time PCR检测：提取总 RNA，逆转录成cDNA后进行，多聚酶链反应（总反应体系20μl：2×SYBR Premix Ex Taq II 10μl、10μmol/L 的上下游引物各 0.8μl、50×Rox Reference DyeII 0.4μl、cDNA 2μl、ddH2O 6μl。反应条件：预变性95℃30s 1 个循环；PCR 反应95℃5s，60℃34s，40 个循环；熔解曲线分析 95℃15s，60℃1min，95℃15s，1个循环）。数据分析：β-actin 作为内参基因，数据分析采用 2-ΔΔCt分析法。引物序列如下：NF-κB（218bp）上 游 5’-AGGAGAGGATGAAGGAGTTGTG-3’， 下游 5’-CCAGAGTAGCCCAGTTTTTGTC-3’；β-actin（101bp）上游5’-CACACTGTGCCCATCTACGA-3’，下游 5’-CTCAGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT-3’。

6 数据分析

利用SPSS 20.0软件进行统计分析，实验结果用均数±标准差（¯x±s）表示。两组比较时采用独立样本t检验；多组比较时，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，当P＜0.05时认为差异有统计学意义。

结 果

1 原代软骨细胞表达II型胶原蛋白并呈甲苯胺蓝异染性

免疫细胞化学染色显示：所有原代软骨细胞均呈II胶原蛋白免疫反应阳性，其胞质呈棕黄色（图1A）；甲苯胺蓝染色显示，所有原代软骨细胞呈蓝紫色，胞质内含有蓝紫色异染颗粒，表明其表达蛋白多糖（图1B）

2 IL-1β降低原代软骨细胞增殖活力

CCK-8法检测显示，10ng/ml IL-1β处理软骨细胞24h后，原代软骨细胞增殖活力显著降低，且随着作用时间的延长（48h及72h），降低增值活力作用有逐渐增强的趋势（图2）；而1、10、20、40ng/ml IL-1β处理SW1353细胞24h，对其增殖活力无明显影响（图3）。

图1 原代软骨细胞鉴定。A，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色；B，蛋白多糖甲苯胺蓝染色；比例尺，100μmFig. 1 Identification of primary chondrocytes. A, immunocytochemical staining for type II collagen; B, toluidine blue staining for proteoglycan; scale bars, 100μm

图2 IL-1β处理对原代软骨细胞增殖活力的影响。与CON组相比，**P＜0.01Fig. 2 Effect of IL-1β treatment on the proliferation activity of primary chondrocytes. Compared with CON group, **P＜0.01

图3 IL-1β处理对SW1353细胞增殖活力的影响Fig. 3 Effect of IL-1β treatment on the proliferation activity of SW1353 cells

3 IL-1β上调原代软骨细胞与SW1353细胞IL-6、MMP-13和NF-κB表达

ELISA测定显示，10ng/ml IL-1β处理可使原代软骨细胞与SW1353细胞系培养基上清中IL-6（图4）和MMP-13（图5）水平均显著升高；Real time-PCR检测表明，10ng/ml IL-1β处理可使原代软骨细胞和SW1353细胞系中NF-κB mRNA表达量显著上升（图6）。

图4 . IL-1β处理对原代软骨细胞及SW1353细胞分泌IL-6的影响。A，原代软骨细胞；B，SW1353细胞；与CON组相比，**P＜0.01Fig. 4 Effect of IL-1β treatment on secretion of IL-6 in primary chondrocytes and SW1353 cells. A, primary chondrocytes; B, SW1353 cells; compared with CON group, **P＜0.01

图5 IL-1β处理对原代软骨细胞及SW1353细胞分泌MMP-13的影响。A，原代软骨细胞；B，SW1353细胞；与CON组相比：*0.01＜P＜0.05；**P＜0.01Fig. 5 Effect of IL-1β treatment on secretion of MMP-13 in primary chondrocytes and SW1353 cells. A, primary chondrocytes; B, SW1353 cells;compared with CON group, *0.01＜P＜0.05, **P＜0.01

图6 IL-1β处理对原代软骨细胞及SW1353细胞NF-κB mRNA表达的影响。A，原代软骨细胞；B，SW1353细胞；与CON组相比：*0.01＜P＜0.05；**P＜0.01Fig. 6 Effect of IL-1β treatment on expression of NF-κB mRNA in primary chondrocytes and SW1353 cells. A, primary chondrocytes; B, SW1353 cells;compared with CON group, *0.01＜P＜0.05, **P＜0.01

讨 论

来源于患者的原代软骨细胞与永生化的软骨肉瘤细胞系都是常用于OA体外研究的细胞[9,10]，相比于细胞系，原代软骨细胞可以更好的体现OA进程中细胞内环境的变化、OA产物及通路等的表达变化，但来源不易、且分离步骤较烦琐，培养时间较长。在本实验中，原代软骨细胞基本爬满培养瓶瓶底需两周左右。SW1353细胞系优点就在于增殖活力强、较易获得和易于培养等（如本实验中，SW1353细胞系基本爬满培养瓶瓶底只需48 h ～72 h），但由于其是肿瘤细胞系，表型、特性等方面的代表性较原代细胞差。

由于本实验培养的原代软骨细胞提取自患者关节组织，可能混有骨细胞、巨噬细胞等，而II型胶原主要是由软骨细胞特异性分泌的，因此，为鉴别我们所培养的细胞是否为软骨细胞，本实验选用免疫细胞化学法与甲苯胺蓝染色法分别检测细胞中Ⅱ型胶原与蛋白多糖的表达。结果显示Ⅱ型胶原与蛋白多糖表达均呈阳性，说明本实验所培养的原代细胞为软骨细胞。

体外实验中，常用IL-1β做诱导剂来模拟OA炎症环境[11]。为探讨IL-1β对原代软骨细胞及SW1353细胞系的增殖活力的影响，我们采用CCK-8法检测细胞活力。结果显示，IL-1β（10 ng/ml）处理不同时间均可显著抑制原代软骨细胞增殖活力，但抑制作用并未随作用时间延长而增强， 这与Li等人的研究结果相同，即 IL-1β（10 ng/ml～25 ng/ml）作用6h～48h后可抑制原代软骨细胞增殖活力[12]。但不同浓度IL-1β处理下，对SW1353细胞增殖活力却无明显影响，Ji[13]等人研究也显示IL-1β（5 ng/ml）处理24 h对SW1353细胞增殖活力无明显影响的结果一致。这可能是由于作为肿瘤细胞系，SW1353细胞本身的增殖活力很强，掩盖了IL-1β对其增殖活力的抑制作用。

IL-6的升高往往预示着炎症反应加重[14]，而MMP-13合成及活性的上调均可引起Ⅱ型胶原在OA中的过度裂解[15]，是反映关节软骨退变程度的重要标志物[16,17]。本研究结果显示，IL-1β处理后原代软骨细胞与SW1353细胞培养上清中IL-6和MMP-13的表达量均显著增加，提示IL-1β可诱导原代软骨细胞及SW1353细胞出现OA样炎症反应。对于SW1353细胞来说，虽然IL-1β并不能引起细胞增殖活力的抑制，但却可显著增加炎症因子的表达，说明IL-1β作为体外OA模型的诱导剂一样适用于SW1353细胞系。在本研究中还发现，原代软骨细胞培养上清中IL-6的表达量要高于SW1353细胞系，这有可能是由于本实验所培养的原代软骨细胞取自OA患者，细胞本身已经处于炎症环境。

NF-κB是一种广泛参与免疫炎症反应进程的核蛋白因子，调节多种基因表达，同时还可促进多种炎症因子，如IL-1β、MMPs的合成与分泌，在OA进程中发挥着重要的作用[18,19]。本实验结果显示，IL-1β处理可使原代软骨细胞与SW1353细胞中NF-κB mRNA的表达量均显著升高，提示IL-1β可通过激活NF-κB信号通路诱导原代软骨细胞与SW1353细胞系发生OA炎症反应。可推测，虽然两种细胞炎症反应程度存在差异，但引起炎症反应的机制可能相同。

综上所述，IL-1β可诱导原代软骨细胞及SW1353细胞系出现OA炎症反应，但在细胞增殖活力、炎症因子的表达等方面依然存在一定差异。研究者可根据实验目的及客观条件选择不同的细胞作为研究OA的体外模型。