无创基因检测(NIPT)对胎儿染色体异常筛查的临床应用

左 娟，刘 洁，朱 瑾，江玲玲，黄建成，李朝晖

(福建医科大学附属闽东医院检验科，福建宁德 355000)

染色体是人类基因的载体，包括常染色体和性染色体。染色体数目和结构的异常不仅是导致胎儿流产、死胎、发育畸形的常见原因，也是引起新生儿出生缺陷的重要原因之一。常见的染色体异常有21-三体综合征、13-三体综合征和18-三体综合征等。传统的唐氏筛查主要是用来评估孕妇怀有21-三体、18-三体综合征胎儿的风险。随着孕妇外周血中胎儿游离DNA片段的发现[1]和高通量测序技术的发展，无创产前基因检测(NIPT)已逐步成为广大孕妇筛查21-三体、18-三体综合征胎儿的首选。同时NIPT对胎儿其它染色体异常，如13-三体，性染色体也有一定的提示作用。本研究就是通过分析6 357例孕妇NIPT 结果来评价其在筛查胎儿染色体异常方面的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取2016年4月～2018年4月自愿在我院行NIPT的单活胎孕妇6 357例。孕妇年龄分布范围为14～48岁，孕周均在12～33+6周。所有孕妇按孕周分为早孕期组(12～14+6周)、中孕期组(15～20+6周)和晚孕期组(≥21周)，按孕龄分为高龄组(≥35岁)和低龄组，低龄组又按申请NIPT理由分为唐氏筛查高风险组、临界风险组、单项指标或MOM值异常组、B超软指标异常组和直接选择NIPT组。

1.2 试剂与仪器 华大基因BGIDL-50全自动样品加载系统，BGISP-300全自动NIPT样品制备系统，BGISEQ-500测序仪，美国Genetix公司GSL-120全自动高通量染色体扫描平台，华大基因核酸提取试剂，测序反应通用试剂盒(联合探针瞄定聚合测序)，胎儿非整倍体(T21，T18，T13)检测试剂盒(联合探针瞄定聚合测序)，杭州宝莱羊水/绒毛细胞培养基。

1.3 方法

1.3.1 NIPT标本采集：在知情同意原则下，抽取孕妇5 ml静脉血至gene seek公司的血浆游离DNA真空保存管中，上下颠倒混匀10次，当天立即送至华大基因临床检验中心，由其完成后续的检测。

1.3.2 羊膜腔穿刺术：腹部常规消毒铺巾，在B超引导下医生按照无菌操作规范，抽取羊水20 ml，分至两个无菌离心管中，各10 ml。将两管羊水2 000 r/min离心10 min，弃上清，各加4 ml羊水细胞培养基，混匀，接种于两个T25培养瓶中，分别放入两个37℃，5 ml/dl CO2培养箱中培养，第7天观察细胞生长情况，对贴壁比较好的细胞换液，换液后第二天观察细胞克隆生长情况，如果大的细胞克隆≥12个就可以加入秋水仙素10 μl(100 mg/ml)，作用30 min后，常规收获、制片、G显带，经GSL-120全自动扫描分析系统扫描后计数分析羊水细胞的染色体核型。

1.4 统计学分析 用spss11.0软件对不同孕期和不同申请理由各组NIPT结果采用计数资料多个样本率多重比较的χ2检验进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同孕期组NIPT结果分析 见表1。6 357例孕妇按孕周分为早、中、晚孕期组，各组NIPT阳性情况，经多个样本率多重比较的χ2检验发现，各孕期组NIPT的阳性率之间差异无统计学意义(χ2=2.26～6.052，均P>0.05)。

表1早、中、晚孕期组NIPT阳性情况

2.2 按孕龄和申请NIPT理由分组，各组NIPT结果分析 见表1。将6 357例孕妇按孕龄分为高龄组(≥35岁)和低龄组，低龄组又按申请NIPT理由分为唐氏筛查高风险组、临界风险组(21-三体风险值界与1/270和1/1 000之间，18-三体风险值界与1/350和1/1 000之间)、单项指标或MOM值异常组，B超软指标异常组和直接选择NIPT组，各组NIPT阳性经多个样本率多重比较的χ2检验发现，不同申请理由NIPT阳性率之间差异无统计学意义(χ2=0.017～1.809，P值均>0.05)。

表2按孕龄和申请理由分组，各组NIPT阳性情况

注：申请理由有合并两项及以上的在分组时优先入组顺序为高龄、唐氏筛查异常、B超异常。

2.3 羊膜腔穿刺羊水细胞染色体检查对NIPT结果的验证 本研究6 357例孕妇共检出疑似染色体异常76例，其中21-三体20例，确诊16例，2例自然流产，诊断率为90%，阳性预测值为88.89%；18-三体9例，8例确诊，1例误诊，诊断率为100%，阳性预测值为88.89%；13-三体4例，确诊2例，误诊2例，诊断率为100%，阳性预测值为50%；性染色体31例，确诊16例，误诊10例，5例拒绝行羊水细胞染色体检查，诊断率为83.9%，阳性预测值为61.54%。其它染色体异常12例，只有7例行羊膜腔穿刺羊水细胞染色体检查，且7例均误诊。

3 讨论

出生缺陷是我国新生儿常见疾病之一，染色体异常又是导致出生缺陷的重要原因之一。其中常染色体异常可表现为不同程度的智力低下，生长发育迟缓及外观、器官畸形，性染色体异常可表现为性腺发育不全、两性畸形等。目前，针对这些染色体异常尚无有效的治疗方法，只能通过二级预防尽量避免此类患儿的出生，尤其是21-三体综合征患儿。

NIPT是基于母体外周血中含有胎儿游离DNA片段(cell-free fetal DNA，cffDNA)的基础上发展起来的一种检测技术。母体外周血中的cffDNA几乎全部来源于胎盘滋养层细胞，其在怀孕4周就可检出，孕8周后含量逐渐上升并稳定存在，直至胎盘娩出2 h后不再被检出。NIPT要求孕妇外周血中cffDNA的含量大于5%才可进行，故2016年国家卫计委妇幼司将NIPT的最小检测孕周定为≥12周。本研究所选取的研究对象孕周均≥12周，所有孕妇按孕周分组，各组阳性率之间无统计学差异。分析各组NIPT阳性结果构成发现早孕期组的染色体异常主要是21-三体、18-三体和13-三体，中孕期组的染色体异常主要是性染色体、21-三体和18-三体，晚孕期组主要是性染色体和其它染色体异常(微缺失和微重复等)。鉴于NIPT对其它染色体微缺失微重复的敏感度和特异度没有确切数据[2]，故针对胎儿21，18，13-三体和性染色体异常的诊断，孕妇可以在孕12周后尽早行NIPT，为后续的介入性产前诊断争取更多的时间。

本研究将所有孕妇按孕龄分高龄组和低龄组，高龄组共检出疑似染色体异常37例，阳性率为1.45%(37/2 560)，而低龄组阳性率1.03%(39/3 797)，两组之间差异无统计学意义(χ2=2.264，P>0.05)，由此证实高龄孕妇可以将NIPT作为诊断染色体异常的首选，不必要按传统直接行羊膜腔穿刺，这与殷一旋等[3]报道不同。本研究又将低龄组按申请理由分组，各组阳性率之间亦无统计学差异，B超软指标异常孕妇或错过唐氏筛查时间的孕妇可以直接选择NIPT检测胎儿染色体异常、唐氏筛查高风险、临界风险、单项指标或MOM值异常的孕妇可以将NIPT作为二线筛查，仍为异常时再行羊膜腔穿刺，从而避免不必要的羊水穿刺。由于本研究的B超软指标异常大多为左心室强回声点、肾盂增宽、双侧脉络丛囊肿、NT增厚等单一异常，对复杂B超异常缺乏数据，故笔者建议复杂B超异常者直接行羊膜腔穿刺羊水细胞染色体检查，毕竟NIPT诊断胎儿染色体异常的种类有限。另外，从进行NIPT孕妇的构成比来看，唐氏筛查临界风险组的孕妇更愿意行NIPT，占所有孕妇的43.38%(1 647/3 797)，这与瑞士一项研究相符[4]，与我国卫计委明确规定将传统唐氏筛查临界风险的孕妇列为NIPT的适应症之一相符。

本研究通过羊膜腔穿刺羊水细胞染色体检查对NIPT阳性结果进行验证发现，孕妇对21，18，13-三体和性染色体异常具有较高的重视，其诊断率相对较高，且诊断结果提示NIPT对21，18-三体具有较高特异度，但对于13-三体、性染色体仍具较高的假阳性率，这与国内外的报道相似[5，6]，NIPT对于其它染色体异常基于孕妇的诊断率不高及羊水细胞染色体核型分析的局限性，本研究无法探讨。

综上所述，NIPT对21，18-三体具有较高的特异度和敏感度，孕妇尤其是高龄孕妇可以在孕12周后尽早行NIPT，及早发现染色体异常胎儿，而对于唐氏筛查高风险、临界风险和单项指标或MOM值异常的孕妇可以将NIPT作为二线筛查，避免不必要的羊膜腔穿刺。B超异常的孕妇可以根据异常情况选择NIPT或羊膜腔穿刺。虽然NIPT以其无创性被广大孕妇所接受，但基于技术的局限性，目前只能用于21，18，13-三体和性染色体非整倍体的检测，对与其它染色体异常，尤其是微缺失微重复等结构异常有待进一步的开发和研究，这也是NIPT将来发展的趋势。