应用质谱技术探究血液中游离脂肪酸与高血糖病症之间的关系

汪衍民

(菏泽市立医院检验科，山东菏泽 274031)

糖尿病几乎是世界上所有国家中最常见的慢性疾病之一。最新的流行病学调查结果表明，中国大于20岁的人群患糖尿病的概率达到9.7%，前期糖尿病的患病率达到15.5%，严重威胁了人们的生命健康[1]。尽可能的维持血糖值在正常水平是预防糖尿病的最主要任务。最新的研究显示，血糖值与死亡率存在明显的相关性[2，3]。当血糖值超过规定的水平时就会形成高血糖症。高血糖是通常所说的“三高”中的一高，包括糖尿病前期和糖尿病，不良的生活习惯是导致高血糖的一个重要原因。膳食中的脂肪与糖尿病发生密切相关[4～7]，本文研究了高血糖患者血浆游离脂肪酸的组成和含量，并与正常健康者相比较，进行分析讨论，研究结果表明血浆中游离脂肪酸(FFA)与高血糖症密切相关。

1 材料与方法

1.1 实验对象 所有的血样均来自菏泽市立医院(中国山东省)，其中包括50例健康对照(平均年龄60.3±5.6岁，男女比例为1∶1)和50例高血糖患者(平均年龄59.6±6.3岁，男女比例为1∶1)。高血糖患者空腹血糖值大于8.0 mmol/L。所有的实验对象均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸以及N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(NEDC)，均购买于西格玛奥德里奇(St.Louis，MO，美国)。色谱纯的甲醇、乙醇购买于飞世尔科技(美国)，分析纯的氨水购买于国药试剂有限公司。共振质谱仪(德国布鲁克公司)。

1.3 实验方法 血浆样本经甲醇沉淀蛋白后，用正己烷萃取血浆游离脂肪酸。以NEDC与氨水混合物作为基质，十七烷酸为内标，采用MALDI-FTICR MS(德国布鲁克公司)进行分析。通过与精确分子质量相比较的方法定性(相对质量偏差小于1 ppm)，样品峰强度与内标峰强度之比定量，即运用标准曲线法计算各脂肪酸的含量。

1.4 质谱条件 取0.3 μl样本，点于MTP ground steel MALDI靶上，室温干燥后，进行质谱分析。激光源Nd：YAG，波长355 nm。参数设置：负离子模式，每张谱图累加500 shots；采集范围：m/z 150～400。MALDI目标电压为-500v。激光能量为55%。采用三种混合物进行仪器校正，包括十五(烷)酸(C15：0)(MW=242.224 03 Da)，珍珠酸(C17)：0(MW=270.255 33 Da)以及二十一烷酸(C21)：0(MW=326.317 93 Da)。

2 结果

2.1 建立标准曲线 见表1。另配制含9种脂肪酸的6个不同浓度的混标溶液，配制浓度涵盖血浆中脂肪酸浓度范围。取各浓度混标溶液各10 μl，加入1 μl内标溶液，再与10 μl基质溶液混匀，取0.3 μl点在MALDI靶上，室温下挥干后进入质谱仪分析。以横坐标为脂肪酸浓度与内标浓度比，纵坐标为其峰强度比绘制标准曲线。

表1 9种脂肪酸标准品的线性回归方程和最低检出限

2.2 健康对照与高血糖患者血浆游离脂肪酸的比较 见表2。

脂肪酸正常对照高血糖患者P肉豆蔻酸棕榈油酸棕榈酸亚麻酸亚油酸油酸硬脂酸花生四烯酸二十二碳六烯酸5.99±1.7511.22±2.9061.41±22.710.68±0.3528.69±13.7146.40±21.17101.03±29.260.91±0.560.26±0.198.06±4.2115.05±7.37106.68±30.422.17±0.8496.66±35.45117.11±57.58169.02±40.786.09±3.412.12±1.600.024 40.043 00.000 10.000 10.000 10.000 10.000 10.000 10.000 1

正常对照与高血糖患者血样分析质谱图见图1，共检测出9种脂肪酸。上述标准曲线用于定量分析血浆游离脂肪酸，其含量用中位数表示。由于不符合正态分布，随机设计两组独立样本的秩和检验，对检测结果进行统计计算，P<0.05，差异有统计学意义，统计结果表明疾病组中的脂肪酸均明显高于对照组。

注：A.正常对照；B.高血糖患者。

2.3 ROC曲线 见表3。ROC曲线是以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线，反映了生物标志物对疾病的诊断效率。血浆游离脂肪酸诊断高血糖的ROC曲线。

表3血浆游离脂肪酸诊断高血糖的ROC曲线结果

脂肪酸ROC曲线下面积灵敏度(%)特异度(%)所有脂肪酸肉豆蔻酸棕榈油酸棕榈酸亚麻酸亚油酸油酸硬脂酸花生四烯酸二十二碳六烯酸饱和脂肪酸单不饱和脂肪酸多不饱和脂肪酸1.0000.6310.6180.8920.9670.9870.9500.9180.9890.9850.9600.9550.992100.064.158.284.392.295.888.486.197.896.092.096.398.1100.063.962.376.490.196.086.482.292.393.986.284.594.3

2.4 偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)结果 利用Originpro 8.0软件，对测得脂肪酸代谢物的含量信息进PLS-DA聚类分析，采用监督模式，制作出三维图谱明显聚为两类，见图2。

注：红色代表正常对照，蓝色代表高血糖患者。

3 讨论

本研究采用MALDI-FTICR MS检测高血糖患者血浆游离脂肪酸，该方法快速、简便、灵敏度高，避免了繁杂的样本前处理过程，并通过建立标准曲线定量分析，克服了离子抑制现象。采用高分辨质谱，避免了分子量重叠的问题，有效地克制了基质和其它杂质的干扰，降低了鉴定错误的概率[8]。脂肪酸仅有C，H，O三种元素组成，通过与精确分子质量对比来进行鉴定，方法快捷、精准。Sidossis等[9]的研究表明，高血糖能够增加体内葡萄糖的吸收和氧化，抑制肝脏中脂肪酸的氧化，从而促使脂肪酸合成三酰甘油，增加三酰甘油的生产率。本方法共检测了9种游离脂肪酸，包括3种饱和脂肪酸和6种不饱和脂肪酸，统计结果表明，疾病组中的脂肪酸水平均明显高于对照组，这与国外的研究是一致的[10，11]。当前，对于高血糖病人中不饱和脂肪酸含量升高的机制尚不明确，Clore等[12]认为糖尿病患者中饱和脂肪酸的升高与内源性葡萄糖产物的增加有关。提升的游离脂肪酸水平可能会影响胰岛素分泌，并导致2型糖尿病的发生[13，14]。所以，维持血糖值在正常水平对于预防糖尿病至关重要。

ROC曲线的结果显示，多不饱和脂肪酸对高血糖疾病的诊断能力高于饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸。多数的研究认为，多不饱和脂肪酸可以增加胰岛素的敏感性，与糖尿病的危险性呈负相关[15]，但也有研究认为增加n-3系列的多不饱和脂肪酸供给并不能减少2型糖尿病的患病风险，反之，有可能会轻度增加糖尿病的发病率[16，17]。因此，脂肪酸与糖尿病的关系与作用机制有待于进一步研究。

本研究借助MALDI-FTICR MS代谢组学方法对50例高血糖患者和50例健康对照的血浆游离脂肪酸谱进行研究。基于定量结果，利用数据处理和模式识别方法，将高血糖组与对照组进行聚类分析，结果显示，两组有明显的差别。因此，检测高血糖患者血浆游离脂肪酸代谢谱，对于代谢性疾病的诊断也具有很重要的意义。