超声辅助脱脂对牦牛骨粉制备及其理化特性的影响

秦晓洁，沈青山，贾 伟，张春晖,，郑乾坤



超声辅助脱脂对牦牛骨粉制备及其理化特性的影响

秦晓洁1，沈青山1，贾 伟1，张春晖1,2※，郑乾坤2

（1. 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；2. 得利斯集团有限公司，潍坊 262216）

为提高牦牛骨粉的脱脂率，以青海牦牛股骨为原料进行超声辅助有机溶剂脱脂参数优化，并比较分析了超声脱脂法和蒸煮脱脂法对骨粉制备的影响。该文以脱脂率为指标筛选高效脱脂溶剂；通过响应面法对超声脱脂参数（超声功率、脱脂时间及液料比）进行优化；对比分析了2种脱脂牦牛骨的脱脂率、蛋白质流失率、主要矿物质流失率、微观形态及其骨粉的粒径分布、微观形态、化学结构和钙离子释放度。结果显示：乙酸乙酯为最佳脱脂溶剂；超声功率500 W，超声时间30 min，液料比（体积质量比）6为最佳脱脂参数，此条件下脱脂率达92.00%，显著高于蒸煮脱脂法（71.25%）（<0.01）；与蒸煮脱脂法相比，超声脱脂法蛋白质流失率（8.11%），主要矿物质元素Na、K、Fe、Mn流失率显著降低（<0.05），微观结构更加致密；超声脱脂法和蒸煮脱脂法制得牦牛骨粉中值粒径（D50）分别为35.84和11.73；红外光谱显示两者化学结构无明显变化；钙离子释放度结果显示两者同样无显著差异（>0.05）。超声波辅助有机溶剂脱脂处理制备骨粉可更多保留骨中营养物质，对改善骨粉加工工艺及提高骨粉品质具有一定的参考价值。

超声；脱脂；溶剂；牦牛；骨粉；蒸煮

0 引 言

牦牛是生活在中国青藏高原的特色物种之一，牦牛骨骼（yak bone，YB）占躯体总生物量1/3，富含胶原蛋白、软骨素、维生素以及钙、磷、镁、锌等骨生长必需的营养素[1-2]，其中胶原蛋白占总蛋白质量的35%～40%[3]。研究表明，动物骨中的蛋白质具有很高的营养价值[4]，其中的骨胶原蛋白肽能改善人体皮肤肤质[5]，促进大鼠股骨的骨折愈合和人成骨细胞I型胶原蛋白基因的表达[6]。此外，骨骼中的Ca∶P比值近似为2，是人体吸收钙磷的最佳比例[7]，但多以磷酸钙形式存在于羟基磷灰石晶体中，溶解度很低并且羟基磷灰石与胶原蛋白有机结合，难以得到有效利用[8-9]。

对原料骨进行脱脂处理是骨粉制备的前提。目前，以牦牛骨为原料开发了骨粉、明胶等一些基础生化原料和牦牛骨髓壮骨粉等保健品[10-11]。赵要武等[12]研究发现牦牛骨粉（yak bone powder，YBP）可增加骨密度，并具有较高的钙表观吸收率。但牦牛骨中含有大量油脂，其产品极易氧化酸败，产生不良风味和有害物质[13]，影响产品感官品质，危害身体健康[14-15]。同时，脂肪的存在不利于畜骨进一步粉碎，阻碍蛋白质溶出和矿物质元素吸收，对骨粉品质有很大影响[16-17]。脱脂处理可以明显改善肉骨粉的风味和色泽，显著提高肉骨粉的品质[18]。传统的动物脱脂法有机溶剂法、酶法、酸碱法、蒸煮法和超声波乳化法等[19]，普通有机溶剂法脱脂率较高，但存在耗时长、溶剂残留等问题；酶法不易分离，后续加工困难且成本高；酸碱法脱脂率较高，但容易对原料中的蛋白等营养物质造成损伤，污染环境不利于实际生产；蒸煮法在生产实践中以高温高压蒸煮为主，但脱脂率低，生产成本较高，易造成营养物质损失。

超声辅助脱脂技术是利用超声波产生的空化作用及伴随产生的热效应、机械效应等次级效应，能够有效加速油脂的扩散和溶出[20-21]。超声波辅助乳化剂可使猪皮的脱脂率达到68.67%[22]；超声辅助常温脱脂可使蚕蛹的脱脂率达到96.8%[23]。然而使用超声波辅助有机溶剂对骨原料脱脂制备骨粉的研究尚未见报道。本研究对超声波辅助有机溶剂脱脂方法进行优化，旨在提高脱脂率的同时保留更多营养成分以提高产品质量和稳定性，为改善牦牛骨和其他畜禽骨骨粉加工工艺提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料骨：随机选取来自青藏地区的2～3岁牦牛6头，屠宰后取其股骨（不含软骨）剔除碎肉、筋等杂质，粉碎得到5～10 mm的骨颗粒于–20 ℃保存备用。

试剂：无水乙醇，异丙醇，正己烷，乙酸乙酯，氢氧化钠，浓硫酸，高氯酸，异丙醇，硝酸，无水乙酸钠，一水柠檬酸，正丙醇，氯胺，对二甲氨基苯甲醛，氧化镧，碳酸钙，盐酸，胃蛋白酶（1 200 U/g）。以上试剂皆为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FW 100高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；欧诺全温度恒温培养摇床（天津市欧诺仪器仪表有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（天津市中环实验电炉有限公司）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）； SER148脂肪测定仪（意大利VELP公司）；KJELTEC2300型全自动凯氏定氮仪（丹麦FOSS公司）；行星式球磨仪PM200（上海弗尓德仪器设备有限公司）；CAMSIZER X2（上海弗尓德仪器设备有限公司）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；双光束原子吸收分光光度计（日本岛津公司）；傅里叶近红外光谱分析仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR，瑞士Bruker公司）；场发射环境扫描电子显微镜（日本Hitachi公司）。

1.3 方法

1.3.1 牦牛骨基本成分测定

脂肪含量测定：索氏抽提法，依照GB5009.6-2016进行。水分含量：直接干燥法，依照GB5009.3-2016进行。灰分含量：马弗炉高温灼烧法，依照GB5009.4-2016进行。蛋白质含量：凯氏定氮法，依照GB5009.5-2016进行。羟脯氨酸含量：依照GBT9695.23-2008进行测定。Ca含量测定：火焰原子吸收光谱法，依照GB5009.92- 2016进行。矿物质含量测定：电感耦合等离子体质谱法，依照GB5009.268-2016进行。

1.3.2 牦牛骨脱脂参数优化试验

1）脱脂工艺

蒸煮脱脂法[24]：牦牛腿骨（30 g）→剔除筋膜、肉等杂质→初步粉碎（5～10 mm）→称样并预煮2 min去腥→沥干→高温高压蒸煮处理（118℃，90 min，骨：水比为1：2.5）→撇除上层油脂并沥干→75 ℃条件下通风干燥12 h。

超声脱脂法：牦牛腿骨（30 g）→剔除筋膜、肉等杂质→初步粉碎（5～10 mm）→称样→与脱脂溶剂以一定的液料比混合→超声脱脂处理→溶剂回收→38℃条件下通风干燥12 h→测定残留脂肪含量。

2）脱脂溶剂的筛选

基于不同脱脂溶剂在其他脱脂研究中的应用条件，本试验中分别选取无水乙醇、异丙醇、正己烷、乙酸乙酯作为脱脂溶剂，在超声功率300 W、液料比（体积质量比，下同）为2、时间为20 min的条件下（常温）对牦牛骨进行超声脱脂，测定脱脂前后牦牛骨中的脂肪含量，比较4种不同溶剂的脱脂效果，计算脱脂率。

3）单因素试验设计

在30 ℃的恒定水温条件下对牦牛腿骨进行超声脱脂单因素实验，各因素的基本条件为：超声功率300 W、脱脂时间20 min、液料比为2。各因素梯度分别设置为：超声功率：200、300、400、500、600 W；脱脂时间：20、30、40、50、60 min；液料比：2、3、4、5、6。每次改变其中一个因素，进行单因素试验。以牦牛骨的脱脂率为评价指标，每个因素重复试验3次，测定结果取平 均值。

4）响应面试验设计

在单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，考察超声功率、脱脂时间、液料比3个因素及其交互作用对脱脂率的影响，试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面设计因素及水平表

1.3.3 脱脂率、胶原蛋白含量及流失率计算

脱脂率的计算：取5 g脱脂牦牛骨，依照GB 5009.6- 2016对其脂肪含量进行测定，做3次平行，取平均值，脱脂率的计算按照公式（1）。

式中为脱脂率，%；1为原料牦牛骨中脂肪的质量，g；0为脱脂牦牛骨中脂肪的质量，g。

胶原蛋白含量的计算：取100 mg脱脂牦牛骨，依照GB/T9695.23-2008对其羟脯氨酸含量进行测定，做3次平行，取平均值，胶原蛋白含量及流失率的计算分别按照公式（2）、（3）。

式中羟脯氨酸为羟脯氨酸质量，mg；为胶原蛋白质量，mg；为胶原蛋白流失率，%；0胶原蛋白为原料牦牛骨中胶原蛋白质量，mg；1胶原蛋白为脱脂牦牛骨中的胶原蛋白质量，mg，6.77为羟脯氨酸与胶原蛋白之间的换算系数[25]。

1.3.4 牦牛骨粉制备

备用脱脂牦牛骨用高速万能粉碎机粉碎45 s（15 s/次，共3次），筛分获得60～100目牦牛粗骨粉，用行星式球磨仪制备牦牛骨粉备用[26]。参数设置：350 r/min，4 h，磨球直径为10 mm。

1）牦牛骨及骨粉主要矿物质流失率计算

牦牛骨及骨粉主要矿物质含量依照GB 5009.268-2016进行测定，做3次平行，取平均值，流失率率的计算按照公式（4）。

式中0矿物质元素为原料牦牛骨中矿物质元素质量，mg，1矿物质元素为脱脂牦牛骨中矿物质质量，mg，为矿物质元素流失率，%。

2）牦牛骨粉粒度分布及其微观形态观察

粒度分布：牦牛骨粉的粒度分布采用CAMSIZER X2测定，骨粉的平均粒径采用中值粒径50表示。

微观形态：牦牛骨及骨粉的微观形态参考Yin等[27]，采用扫描电镜观察，加速电压为10 kV。

3）牦牛骨粉化学结构分析及钙离子释放度测定

化学结构分析：化学键分析参考Boutinguiza等[28]的方法，用FT-IR红外光谱分析仪分析，波数扫描范围为600～4 000 cm–1。

钙离子释放度检测：称取0.25 g牦牛骨粉于50 mL离心管（精确至0.001 g），加入25 mL消化液（用HCl调至pH值为2），添加胃蛋白酶（60 U/mL），混匀，封口。将上述离心管放置37 ℃恒温摇床提取3 h，100 r/min。提取结束后，在4 000 r/min条件下离心30 min。取上清过滤并定容至100 mL容量瓶，稀释100倍后用火焰原子吸收光谱仪进行检测[29]。做3次平行试验。其计算公式如（4）。

式中为牦牛骨粉钙离子释放度，%；上清钙为上清液中钙的质量，mg；样品钙为样品中钙的总质量，mg。

1.3.5 数据处理方法

运用SPSS22.0软件one-way ANOVA 对数据进行方差分析同时利用 Duncan 新复极差法进行显著性检测，其中各图同一指标中不同字母表示差异显著（<0.05或<0.01）运用Origin8.0作图；利用Design-Expert 8.0软件对响应面的数据进行方差和线性回归分析。

2 结果与分析

2.1 牦牛骨基本成分含量表

牦牛骨基本成分含量如表2所示。脂肪含量高达25.15%，不利于骨的进一步粉碎，其产品极易氧化酸败，严重影响骨粉品质[16-17]。蛋白含量为24.90%，高于鲁西牛、延边牛、南阳牛、秦川牛的同部位蛋白含量[30]。这表明，牦牛骨虽然富含营养成分但脂肪含量较高，因此有必要对牦牛骨进行脱脂处理。

表2 牦牛骨主要成分含量

2.2 超声波辅助有机溶剂脱脂参数优化结果分析

2.2.1 单因素试验结果

由图1a可以看出，正己烷和乙酸乙酯脱脂效果显著优于无水乙醇和异丙醇，二者之间无显著差异（>0.05）。此外，乙酸乙酯具有良好的溶解性、挥发性，其沸点低、毒性小，是一种易于回收并被国家标准规定允许使用的食品添加剂。因此最终选取乙酸乙酯作为最适脱脂溶剂。

由图1b可以看出，牦牛骨脱脂率随超声功率的增大呈递增趋势，可能由于功率增大，空化效应和机械振动增强，其具有的能量和波动性促进了分子的扩散速度[19]，从而促进骨中油脂的溶出。当超声功率为400 W时，其脱脂率为76.8%。但当超声功率超过400 W时，脱脂率变化减缓，这可能是由于脱脂溶剂的溶脂能力已趋于饱和，400与500、600 W的超声功率对脱脂率无显著差异（>0.05）。因此，选取400 W为最佳条件进行后续试验。

注：图1a超声功率300 W，超声时间20 min，液料比2；图1b超声时间20 min，液料比2；图1c超声功率500W，液料比2；图1d超声功率500 W，超声时间30 min；不同字母表示差异显著（P<0.05），下同。

由图1c可以看出，脱脂率随超声时间的延长而不断提高。在超声时间为10～30 min时，脱脂率随超声时间迅速上升，而在30～60 min内，脱脂率增加趋势变缓。超声波的作用由表及里，随着其不断深入牦牛骨内部，油脂的扩散率相应减少[31]。因此，当超声脱脂达到一定时间后，脱脂率增加趋势会减缓。当超声波的作用完全抵达牦牛骨内部时，继续延长时间则不会再产生影响。当脱脂时间为30 min时，脱脂率可达78.2%，且与40、50、60 min时的脱脂效果无显著差异（>0.05），因此选取30 min为后续试验的脱脂时间。

由图1d可以看出，液料比为2～5时，脱脂率随着液料比的增大呈上升趋势。这是由于对于一定质量的牦牛骨来说，溶剂用量的增加会降低溶剂中油脂的浓度，增加牦牛骨与溶剂接触表面的浓度差，从而促使传质推动力的增加[32-35]。当脱脂溶剂用量增大到一定程度后，牦牛骨中的大部分油脂已经溶出，随用量持续增加，油脂溶出渐缓，从经济角度考虑，可选择液料比为5作为后续优化试验的最适条件。当液料比为5时，其脱脂率与液料比为6、7的脱脂率已无显著差异（>0.05），脱脂率可达84.5%。

2.2.2 Box-Behnken试验设计与结果

响应面试验共17个试验点，其中12个为析因点，5个零点试验以估计误差。响应面试验结果如表3所示，1表示脱脂率。

通过Design-Expert 8.0软件对数据进行多元回归拟合分析，脱脂率（1）与超声功率（）、超声时间（）和液料比（）之间建立二次回归模型如公式（6）。

1=80.36+3.83+1.29+2.70+0.52+

1.15+1.19+2.032+0.892+0.812（6）

表3 响应面设计试验结果

2.2.3 回归方程显著性分析

为了考察模型的拟合度，寻找主效应显著性以及各因素之间的相互作用，对回归方程进行ANOVA方差分析，其结果如表4所示。

从表4中可以看出，该模型的<0.01，值为14.29，说明所选模型极显著；失拟项的>0.05，说明其他因素对实验结果的影响较小，该模型在整个回归区域内拟合较好；2Adj–2Pre<0.2，说明该模型可充分说明工艺过程[36]。方差分析结果表明，该模型与试验具有较高的拟合度，能很好的反映出各因素与脱脂率之间的关系。通过值的检验结果发现，该模型一次项、的值小于0.01，对模型贡献大，因此其对脱脂率影响极显著，而一次项、二次项2的值小于0.05，表明其对脱脂率影响显著。此外，交互项、的值小于0.15，是影响脱脂率的重要因子。由检验可以得出超声功率、超声时间和液料比对牦牛骨脱脂率都有一定的影响，其因子贡献率为超声功率>料液比>超声时间，但其交互作用不显著。

表4 方差分析表

注：***表示极显著（0.01），* *表示显著（<0.05），*表示重要因子（<0.15）。

Note: ***represents highly significant (<0.01), **represents significant (< 0.05), *represents important factor (<0.15).

2.2.4 响应曲面与等高线分析

依据回归拟合函数以及各因素对牦牛骨脱脂率的影响，每2个因素对牦牛骨脱脂率画出响应面和等高线图，考虑到定性分析各因素对牦牛骨脱脂率的关系，固定另外1个因素时，均作“0”水平处理。图2为各因素交互作用的响应面和等高线图。

图2 AB、AC、BC交互作用对牦牛骨脱脂率的影响

对牦牛骨脱脂率影响显著的因素，表现为等高线密集、曲线较陡，响应值变化较大；反之，等高线疏松、响应曲面较为平滑，响应值变化较小[37]。因此由图可以判断各因素对响应值的影响程度为：>>；2因素之间的交互作用较弱，影响程度为：>>；与方差分析结果一致。

鉴于不能直接从响应曲面上找出最佳的工艺参数，需要进一步分析。利用Design-expert软件对所得到的回归方程进一步分析，考虑到能耗，在脱脂率大于91%的情况下选择能耗最低的最佳工艺参数：超声功率499.86 W、超声时间30.7 min、液料比5.99，模型预测在此条件下的理论脱脂率为91.02%。为验证响应面所得结果的可靠性，考虑到实际操作的便利、成本等因素，修正工艺参数为：超声功率500 W、超声时间30 min、液料比为6，进行验证试验。使用上述超声脱脂条件进行3次重复验证试验，得到实际牦牛骨脱脂率为92.00%±0.20%，验证值与预测值的相对误差为1.08%，误差较小，表明验证值与模型所得到的预测值基本接近，优化结果具有可靠性。

2.3 不同脱脂方式结果分析

2.3.1 脂肪、蛋白质和胶原蛋白含量比较分析

将牦牛骨分别采用超声波法和蒸煮法进行脱脂处理，获得结果如图3所示。根据公式（1），超声波法和蒸煮法所获得的牦牛骨脱脂率分别为92.00%、71.25%；经脱脂处理后，牦牛骨中总蛋白具有不同程度的流失，由公式（2）、（3）计算得超声波法和蒸煮法蛋白流失率分别为8.11%、13.28%，其中胶原蛋白流失率分别为11.05%、18.40%。2种不同处理方法都会对牦牛骨中蛋白质造成一定程度的流失，牦牛骨经超声波处理后，其中部分与酯类结合的蛋白质随着油脂的溶出而流失；除与酯类结合的蛋白质，牦牛骨中还存在少量水溶性蛋白质，并且高温高压条件下蛋白质三螺旋结构解体，骨组织被破坏，导致牦牛骨蛋白质流失率增大[38]。

图3 不同脱脂方法对牦牛骨中脂肪含量、总蛋白含量以及胶原蛋白含量的影响

2.3.2 矿物质含量比较

利用电感耦合等离子体质谱法对经2种方法处理的脱脂牦牛骨中P、Ca等12种矿物质含量测定，结果如表5所示。经高压蒸煮处理的牦牛骨中Na、K、Fe、Mn等元素流失严重，根据公式（4）计算得流失率分别可达19.00%、58.95%、14.32%、20.86%，这可能由于牦牛骨经过高压高温处理后，部分蛋白质结构解体，骨组织变得疏松多孔，矿物质得以释放并以离子形式游离到水中[37]而流失；经超声波处理的牦牛骨，Fe、Zn、Mn等元素亦存在流失现象，流失率分别为18.66%、2.18%、15.04%，这可能与乙酸乙酯具有一定溶解金属元素的能力有关。但2种脱脂牦牛骨中P、Ca、Mg、Cu、Se、Mo、Sr等元素与原料骨中的含量无明显差异，这可能由于该类元素存在于羟基磷灰石中并与蛋白质紧密结合，很难以离子的形式游离出来。由此，与高压蒸煮相比，超声脱脂法能显著降低矿物质流失率（<0.05），能够更大程度地保留骨粉中的矿质元素。

表5 矿物质含量

注：结果以平均值±标准差表示，a～c为不同样品间存在显著差异（<0.05）。

Note: Results are indicated by mean ± standard deviation, and a-c indicate significant differences between different samples at 0.05 level.

2.3.3 牦牛骨微观形态观察

选取经不同方法处理的牦牛骨，并对其股骨头和股骨体2部分结构进行比较分析，扫描电镜结果如图4所示。经2种方法处理后，牦牛骨在油脂减少的同时，其结构由致密、规则变得疏松、多孔。经超声脱脂处理后，一方面分布在骨结构中的油脂被溶出，使缝隙、孔洞等原有结构更明显突出，另一方面由于超声波所具有的空化效应和机械振动作用，使骨结构产生一定的疏松，孔隙增加。经蒸煮脱脂处理后，股骨体孔洞明显增加，股骨头产生一定程度的破碎，这可能是由于高温打断了胶原蛋白分子内氢键使其三螺旋结构解体[39]，并进一步破坏了与矿物质的结合[40]，这也可能是造成矿质元素流失严重的原因之一。

2.4 不同脱脂方式制备骨粉结果分析

2.4.1 骨粉粒径分布及微观形态比较分析

利用粒度分析仪对经2种方法处理制备的牦牛骨粉进行粒径分布比较分析，结果如图5所示。经球磨后，超声脱脂牦牛骨粉中值粒径为(35.84±0.60)m，90%颗粒分布在75m以内；蒸煮脱脂牦牛骨粉中值粒径为(11.73±0.29)m，90%颗粒分布在40m以内。蒸煮脱脂牦牛骨粉粒径要显著小于超声脱脂牦牛骨粉，分布宽度窄，这是因为牦牛骨经高压高温处理后，其结构遭到破坏，变得更为疏松多孔，从而更利于超微粉碎的进行[24]。

图4 不同脱脂方法对牦牛骨微观结构的影响

图5 牦牛骨粉粒度分布及微观形态比较分析

对经2种方法处理的牦牛骨粉进行扫描电镜分析，结果如图5b、5c所示。蒸煮脱脂牦牛骨粉粒径较小，分布更均匀，大多呈现椭圆形，形状更加规则；超声脱脂牦牛骨粉粒径分布范围较广，存在形状不规则的大颗粒。与牦牛骨扫描电镜图和粒径分布图结果一致。

2.4.2 骨粉化学结构及钙离子释放度分析

傅里叶红外图谱是区分物质差异的一种有效手段。红外光谱分为600～1 300 cm–1的指纹区和1 300～4 000 cm–1的官能区。官能区为高频区，通常被用来检测物质中官能团的种类以及变化[41]；指纹区可反映出单键的伸缩振动和变形振动，吸收峰因分子结构不同而产生差异[42]。

对经2种不同方法处理的牦牛骨粉进行傅里叶红外扫描分析，结果如图6所示。872 cm–1是CO32–的弯曲振动吸收峰，为CO32–进入羟基磷灰石晶格取代PO43–的特征吸收峰[27,43-44]，1 450、1 512 cm–1是CO32–的拉伸振动吸收峰[45]，1 026 cm–1为PO3–1的对称伸缩振动[46]；1 238 cm–1属酰胺Ⅲ带，是C–N伸缩振动和N–H弯曲振动，以及甘氨酸主链脯氨酸侧链上–CH2的非平面摇摆振动的特征吸收峰；1 600～1 700 cm–1多肽主链上C=O伸缩振动，1 647 cm–1属酰胺I带吸收峰；1 743 cm–1为酯类C=O伸缩振动峰，为骨油吸收峰[43]；2 854和2 927 cm–1的吸收峰是C–H有机物拉伸振动吸收峰[43, 47]。

由图6a可得，2种脱脂牦牛骨粉化学结构大体相同，皆以磷酸盐和碳酸盐为主，含有少量的有机物；超声脱脂牦牛骨粉在1 743、2 853、2 922㎝–1处无明显峰值，这可能是由于其油脂去除完全，而蒸煮脱脂牦牛骨粉中残留脂肪高，出现明显峰值。

通过对牦牛骨粉钙离子释放度进行测定，根据公式（5），结果显示二者钙离子释放度无显著差异（>0.05）（如图6b所示）。研究表明75m牦牛骨粉钙离子释放度大于100m骨粉钙释放度[38]，但小于75m牦牛骨粉不同粒径之间钙离子释放度是否存在差异尚未见报道。本研究中，牦牛骨经超声脱脂和蒸煮脱脂后制备2种脱脂骨粉的中值粒径分别为35.84和11.73m，两者分布宽度窄、差距相对较小，因而可能导致其钙离子释放度差异不显著（>0.05）。这一结果同样表明利用高效超声脱脂工艺处理制备的牦牛骨粉粒径虽然大于蒸煮脱脂牦牛骨粉粒径，但并不会显著影响钙离子释放度（> 0.05），说明该种脱脂工艺具有可行性。另外，蒸煮脱脂牦牛骨粉的脂肪含量显著高于超声脱脂牦牛骨粉（如图3所示），较高残留脂肪可能会影响钙离子的释放，从而导致2种骨粉的钙离子释放度没有显著差异（>0.05）。

图6 牦牛骨粉化学结构及钙离子释放度

3 结 论

本文通过响应面法对牦牛骨超声脱脂参数进行了优化，并比较分析了超声脱脂法和蒸煮脱脂法对制备骨粉的影响，得出以下结论：

1）超声脱脂参数优化各因素对脱脂率的影响顺序为：超声功率>液料比>超声时间，其中超声功率和液料比对脱脂率有极显著影响，但两两因素间无明显交互作用；超声脱脂的最佳参数：超声功率500 W、超声时间30 min、液料比为6，在此条件下脱脂率为92.00%± 0.20%。

2）超声脱脂率显著高于蒸煮脱脂率（<0.01），超声脱脂可以更大程度地保留蛋白质、矿物质等营养成分（< 0.01）。

3）超声脱脂后制得骨粉中值粒径（35.84±0.60）m高于蒸煮脱脂后制得骨粉中值粒径（11.73±0.29）m；2种骨粉化学结构和钙离子释放度不存在显著差异。

该研究提供了一种高效脱脂的方法，为改善牦牛骨和其他畜禽骨骨粉加工工艺及提高骨粉品质提供参考。

[1] 赵勇，陈红剑. 牦牛骨中钙、磷及多种微量元素的分析研究[J]. 西藏科技，2010(7)：39－41

[2] 张春晖. 骨源食品加工技术[M]. 北京: 科学出版社，2015.

[3] Fonkwe L G, Singh R K. Protein recovery from mechanically deboned turkey residue by enzymic hydrolysis[J]. Process Biochemistry, 1996, 37(6): 605－616.

[4] Chiesa S, Gnansounou E. Protein extraction from biomass in a bioethanol refinery-possible dietary applications: Use as animal feed and potential extension to human consumption[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(2): 427－436.

[5] Matsumoto H. Clinical effects of fish type I collagen hydrolysate on skin properties[J]. ITE Letters on Batteries, New Technologies and Medicine, 2006, 7: 386－390.

[6] Tsuruoka N, Yamato R, Sakai Y, et al. Promotion by collagen tripeptide of type I collagen gene expression in human osteoblastic cells and fracture healing of rat femur[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 2007, 71(11): 2680－2687.

[7] 魏秋霞. 原辅材料及加工贮藏工艺对牦牛骨浓缩汤品质影响的研究[D]. 雅安：四川农业大学，2008. Wei Qiuxia. Effects of Raw Materials, Processing and Preservation on the Quality of Concentrated Soup of Yak Bone[D]. Ya’an: Sichuan Agricultural University, 2008. (in Chinese with English abstract)

[8] Olszta M J, Cheng X, Sang S J, et al. Bone structure and formation: A new perspective[J]. Materials Science & Engineering R Reports, 2007, 58(3/4/5): 77－116.

[9] Morimura S, Nagata H, Uemura Y, et al. Development of an effective process for utilization of collagen from livestock and fish waste[J]. Process Biochemistry, 2002, 37(12): 1403－1412.

[10] 李青风. 利用牦牛骨制感光用照相材料明胶[J]. 明胶科学与技术，2005 (4)：183－184. Li Qingfeng. Preparation of gelatin for color photofilm with yak bone[J]. The Science and Technology of Gelatin, 2005 (4): 183－184. (in Chinese with English abstract)

[11] 曹雁平. 食品调味技术[M]. 北京：化学工业出版社，2002.

[12] 赵要武，许继取，朱清华，等. 牦牛骨粉对大鼠骨钙、骨密度及骨钙吸收率影响的研究[J]. 食品科学，2007 (6)：321－323. Zhao Yaowu, Xu Jiqu, Zhu Qinghua, et al. Effects of yak bone powder on rat bone calcium, bone density and calcium apparent absorption ratex[J]. Food Science, 2007(6): 321－323. (in Chinese with English abstract)

[13] Derouchey J M, Hancock J D, Hines R H, et al. Effects of rancidity and free fatty accids in choice white grease on growth performance and nutrient digestibility in weanling pigs[J]. Journal of Animal Science, 2004, 82(10): 2937－2944.

[14] Balogh K, Weber M, Erdélyi M, et al. Investigation of lipid peroxide and glutathione redox status of chicken concerning on high dietary selenium intake[J]. Acta Biologica Hungarica, 2015, 58(3): 269－279.

[15] Fekete S G, Andrásofszky E, Glávits R. Pathological changes induced by rancid feed in rats and effects on growth and protein utilisation[J]. Acta Veterinaria Hungarica, 2009, 57(2): 247－261.

[16] 杨晓霞. 牛骨水解蛋白粉制备工艺研究[D]. 呼和浩特：内蒙古农业大学，2016. Yang Xiaoxia. Preparation of Hydrolyzed Protein Powder of Bovine Bone Using Orthogonal Experiment Method[D]. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2016. (in Chinese with English abstract)

[17] Fekete, Sandor Gyoergy, Andrasofszky. Pathological changes induced by rancid feed in rats and effects on growth and protein utilisation[J]. Acta Veterinaria Hungarica, 2009, 57(2): 247－261.

[18] 肖珺，逯良忠，谢丹，等. 脱脂对肉骨粉品质的影响[J]. 中国油脂，2013，38(7)：30－34. Xiao Jun, Lu Liangzhong, Xie Dan, et al. Influence of defatting on the quality of meat and bone meal[J]. China Oils and Fats, 2013, 38(7): 30－34. (in Chinese with English abstract)

[19] 李晔，马良，张宇昊，等. 正交试验优化鱼皮超声乳化法脱脂工艺[J]. 食品科学，2012，33(24)：127－131. Li Ye, Ma Liang, Zhang Haoyu, et al. Optimization of ultrasonic emulsification for the degreasing of fish skin[J]. Food Science, 2012, 33(24): 127－131. (in Chinese with English abstract)

[20] 左笑，张东翔. 超声波在油脂提取中的应用[J]. 粮油加工，2007(11)：70－73.Zuo Xiao, Zhang Dongxiang. Applications of ultrasonic extraction in oils and fats[J]. Cereals and Oils Processing, 2007(11): 70－73. (in Chinese with English abstract)

[21] 刘文媛，贾伟，李侠，等. 超声辅助水热法提取牛骨油工艺参数优化[J]. 农业工程学报，2018，34(8)：283-290. Liu Wenyuan, Jia Wei, Li Xia, et al. Optimization of ultrasonic-heat extraction process of bovine bone oil[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, (Transactions of the CSAE), 2018, 34(8): 283－290. (in Chinese with English abstract)

[22] 陈丽清，陈清，韩佳冬，等. 猪皮超声波乳化脱脂工艺的研究[J]. 食品工业科技，2012，33(16)：265－267. Chen Liqing, Chen Qing, Han Jiadong, et al. Study on ultrasound degreasing of pigskin with emulsifying agents[J]. Science and Technology of Food Industry, 2012, 33(16): 265－267. (in Chinese with English abstract)

[23] 左振宇，喻放，黄艳鸿，等. 蚕蛹超声辅助常温脱脂工艺条件优化[J]. 生物技术通报，2016，32(2)：158－164. Zuo Zhenyu, Yu Fang, Huang Yanhong, et al. The optimization of ultrasound-assisted mesothermal degreasing process of silkworm pupa[J]. Biotechnology Bulletin, 2016, 32(2): 158－164. (in Chinese with English abstract)

[24] 杨红，肖厚荣，张慧，等. 高温蒸煮法制备牛骨粉的工艺研究[J]. 安庆师范学院学报：自然科学版，2015，21(2)：85－88. Yang Hong, Xiao Hourong, Zhang Hui, et al. Studies on the technology for the preparation of cattle bone powder by high-temperature cooking[J]. Journal of Anqing Teachers College: Natural Science Edition, 2015, 21(2): 85－88. (in Chinese with English abstract)

[25] 董宪兵，李侠，张春晖，等. 分光光度法测定畜禽骨素中胶原蛋白含量[J]. 现代食品科技，2013，29(10)：2538－2541. Dong Xianbing, Li Xia, Zhang Chunhui, et al. Determination of collagen content in livestock and poultry ossein by spectrophotometry[J]. Modern Food Science and Technology, 2013, 29(10): 2538－2541. (in Chinese with English abstract)

[26] 尹涛. 纳米鱼骨的制备、特性表征及其对鱼糜胶凝影响的机制研究[D]. 武汉：华中农业大学，2015. Yin Tao. Studies on Preparation and Charaterization of Nano Fish Bone and the Mechanism of Its Influences on Surimi Gelation [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2015. (in Chinese with English abstract)

[27] Yin T, Park J W, Xiong S. Physicochemical properties of nano fish bone prepared by wet media milling[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 64(1): 367－373.

[28] Boutinguiza M, Pou J, Comesaña R, et al. Biological hydroxyapatite obtained from fish bones[J]. Materials Science and Engineering, 2012, 32(3): 478－486.

[29] Jin Zhang, Tao Yin, Shanbai Xiong, et al. Thermal treatments affect breakage kinetics and calcium release of fish bone particles during high-energy wet ball milling[J]. Journal of Food Engineering, 2016, 183: 74－80.

[30] 吴婷，贾伟，管声，等. 5个品种牛骨的营养组成及其含量差异分析[J]. 食品工业科技，2017，38(2)：342－348. Wu Ting, Jia Wei, Guan Sheng, et al. Difference analysis of composition and content in five varieties of bovine bone[J]. Science and Technology of Food Industry, 2017, 38(2): 342－348. (in Chinese with English abstract)

[31] Zhao S, Kwok K C, Liang H. Investigation on ultrasoundassisted extraction of saikosaponins from radix bupleuri[J]. Separation and Purification Technology, 2007, 55(3): 307－312.

[32] Lou Zaixiang, Wang Hongxin, Zhang Ming, et al. Improved extraction of oil from chickpea under ultrasound in a dynamic system[J]. Journal of Food Engineering, 2010, 98(1): 13－18.

[33] 于修烛，李志西，杜双奎. 苹果籽油超声波辅助浸提及产品理化特性研究[J]. 农业工程学报，2005，21(9)：155－159. Yu Xiuzhu, Li Zhixi, Du Shuangkui. Ultrasonic extraction of apple seed oil and its physical-chemical properties[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2005, 21(9): 155－159. (in Chinese with English abstract)

[34] Tian Y, Xu Z, Zheng B, et al. Optimization of ultrasonic- assisted extraction of pomegranate (.) seed oil[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2013, 20(1): 202－208.

[35] Špela S H, Hadolin M, Škerget M, et al. Solvent extraction study of antioxidants from balm (.) leaves[J]. Food Chemistry, 2003, 80(2): 275－282.

[36] 李莉，张赛，何强，等. 响应面法在试验设计与优化中的应用[J]. 实验室研究与探索，2015(8)：41－45. Li Li, Zhang Sai, He Qiang, et al. Application of response surface methodology in experiment design and optimization[J]. Research and Exploration in Laboratory, 2015(8): 41－45.

[37] 李少博，李洪军，贺稚非. 纳米级兔骨粉球磨法制备工艺优化[J]. 农业工程学报，2017，33(14)：300－306. Li Shaobo, Li Hongjun, He Zhifei. Optimization of preparation process of nanometer rabbit bone meal by ball milling[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(14): 300－306. (in Chinese with English abstract)

[38] 肖厚荣，杨红，汪珊珊. 牛骨粉品质及其生物利用率研究[J]. 食品研究与开发，2016，37(12)：5－9. Xiao Hourong, Yang Hong, Wang Shanshan. Studies on the quality and the biological utilization rate of bovine bone powder[J]. Food Research and Development, 2016, 37(12): 5－9. (in Chinese with English abstract)

[39] Arnoczky S P, Aksan A. Thermal modification of connective tissues: basic science considerations and clinical implications[J]. American Academy Orthopaedic Surgeons, 2000, 8(5), 305－313.

[40] Shimp L. Heat resistance of allograft tissue[J]. Cell and Tissue Bank, 2008, 9(4), 259－266.

[41] 俞园园. 类人胶原蛋白-铜螯合物的制备及相关性质研究[J]. 化学与生物工程，2013，30(7)：29－32. Yu Yuanyuan. Study on preparation and properties of the complex of human-like collagen with copper[J]. Chemistry and Bioengineering, 2013, 30(7): 29－32. (in Chinese with English abstract)

[42] 韩克光，甄守艳，范华，等. 钙螯合羊骨胶原多肽的制备及表征分析[J]. 农业工程学报，2015，31(21)：301－307. Han Keguang, Zhen Shouyan, Fan Hua, et al. Preparation and characteristic analysis of calcium-chelated ossein peptide[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2015, 31(21): 301－307. (in Chinese with English abstract)

[43] 阮孝慈，张贵芳，邓宇. 牛骨成分的综合表征分析[J]. 中国科技论文，2017(6)：712－715. Ruan Xiaoci, Zhang Guifang, Deng Yu. The comprehensive characterization of bovine bone tissue[J]. China Sciencepaper, 2017(6): 712－715. (in Chinese with English abstract)

[44] Khoo W, Nor F M, Ardhyananta H, et al. Preparation of natural hydroxyapatite from bovine femur bones using calcination at various temperatures[J]. Procedia Manufacturing, 2015(2): 196－201.

[45] Bonadio T G M, Sato F, Medina A N, et al. Bioactivity and structural properties of nanostructured bulk composites containing Nb2O5and natural hydroxyapatite[J]. Journal of Applied Physics, 2013, 113(22): 493.

[46] 任灿. 超微兔骨与高钙兔糜凝胶的制备及其理化特性研究[D]. 重庆：西南大学，2017. Ren Can. Studies on Production and Physicochemical Property of Superfine Rabbit Bone and the High Calcium Rabbit Mi Gel[D]. Chongqing: Southwest University, 2017.(in Chinese with English abstract)

[47] Boutinguiza. M, Pou J, Comesaña. R, et al. Biological hydroxyapatite obtained from fish bones[J]. Aterials Science and Engineering, 2012, 32(3): 478－486.

Effect of ultrasonic-assisted degreasing on preparation and physicochemical properties of yak bone powder

Qin Xiaojie1, Shen Qingshan1, Jia Wei1, Zhang Chunhui1,2※, Zheng Qiankun2

(1.100193,2.262216)

In order to reduce the degreasing rate and improve the quality of yak bone powder, the ultrasonic assisted organic solvent degreasing method was studied based on the thighbone of Qinghai yak in this paper, and the nutrient contents and physicochemical properties were analyzed comparing with the traditional boiling degreasing method. Firstly, the degreasing solvent was screened according to degreasing rate and applicability among four common organic solvents. Basing on the single factor test, Box-Behnken test was designed to optimize the parameters including ultrasonic power, degreasing time and the ratio of liquid to material. After that, the analysis of the degreasing rate, the loss rate of protein, collagen, main minerals and the microstructure of yak bone treated by ultrasonic and boiling was carried out. Subsequently, the particle size distribution, microstructure, chemical structure and calcium release rate of yak bone powder dealt with the planetary ball mill were shown as well. Results suggested that ethyl acetate was the optimal degreasing solvent with a higher degreasing rate and better applicability under the same conditions. In addition, the two regression model built by response surface design had a good fitting degree with the correlation coefficient of 0.9484 indicating that the model fitted well in the whole regression region.Considering the energy consumption, the optimum degreasing conditions were finally determined as follows: ultrasonic power is 500 W, ultrasonic time is 30min, and the ratio of liquid to material (mL/g) is 6, under which conditions the degreasing rate could reach 92.00%±0.20% and the relative error of the predicted value was 1.08% which was less than 5% revealing that the model was effective. Besides that, it was also found that the degreasing rate of ultrasonic (92.00%±0.20%) was significantly higher than that of boiling method (71.25%±2.31%) (<0.05). Meanwhile, the loss rate of protein and collagen were 8.11%±0.48%, 11.05%±2.45%, respectively, which were dramatically lower (<0.05). And there was a serious loss of Na, K, Fe, Mn in cooked yak bone that were 19.00%±1.44%, 58.95%±1.04%, 14.32%±2.46% and 20.86%±1.29% respectively while the loss about Fe, Zn, Mn in ultrasonic skimmed yak bone was slightly, and the contents of P, Ca, Mg, Cu, Se, Mo, Sr in the bone treated with the two methods were similar (>0.05). As for the microstructure of yak bone, the boiling one was looser and more porous. After pulverization, the median diameter of ultrasonic defatted bone powder was (35.84±0.60)m while the other was (11.73± 0.29)m, which was in agreement with the result of scanning electron microscope. Moreover, no significant difference had been observed in the chemical structure, and there were mainly phosphate and carbonate in two kinds of bone powder. For the calcium release rate of bone powder, result indicated that both methods had no significant difference (>0.05). In conclusion, the ultrasonic assisted organic solvent degreasing method could remain more nutrients with the higher degreasing rate. This study provided a high efficient degreasing method, which has the value for improving the processing technology for preparing the yak bone powder.

ultrasonic; degreasing; solvent; yak; bone powder; boiling

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.034

TS251.9

A

1002-6819(2018)-21-0272-09

2018-06-01

2018-09-19

西藏自治区重点科研项目“特色农产品加工技术与产品开发”；国家“万人计划”科技创新领军人才项目；鸢都产业领军人才资金资助。

秦晓洁，研究方向：畜产品加工利用。 Email：13521156962@163.com

张春晖，研究员，研究方向：肉品科学。Email：r_zch@163.com

秦晓洁，沈青山，贾 伟，张春晖，郑乾坤.超声辅助脱脂对牦牛骨粉制备及其理化特性的影响[J]. 农业工程学报，2018，34(21)：272－280. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.034 http://www.tcsae.org

Qin Xiaojie, Shen Qingshan, Jia Wei, Zhang Chunhui, Zheng Qiankun. Effect of ultrasonic-assisted degreasing on preparation and physicochemical properties of yak bone powder [J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(21): 272－280. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.034 http://www.tcsae.org