添加谷氨酰胺对施氏鲟胚胎发育及各发育期抗氧化生化指标的影响

谢先中 ，陈晓武 ，冉光鑫 ，杨斌 ，王永树

（1.贵州省黔西南民族职业技术学院，贵州 兴义 562400；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

施氏鲟Acipenser schrenckii是中国现存鲟中最具经济价值的优质珍稀鱼类，在黑龙江、乌苏里江、松花江等均有广泛分布。鲟卵径较大，对孵化条件要求较高，温度过高、缺氧、pH变化等条件下易出现滞育死亡。近年来，随着施氏鲟人工养殖技术和规模发展迅速，高质量苗种的供不应求已成为制约施氏鲟养殖产业发展的瓶颈[1-3]。

胚胎发育期是水产动物生命过程中对外界环境最敏感的时期，也是高死亡率的阶段。研究表明，在水体中添加维生素、糖类和氨基酸等营养因子可提高水产动物胚胎的孵化率、成活率。熊铧龙等[4]研究发现，在普安银鲫孵化水体中添加30mg/L维生素C能缩短胚胎孵化时间（提前4.4h出膜），提高胚胎孵化率16.2%，提高仔鱼成活率17.8%。薛凌展[5]对栉孔扇贝的研究结果表明，2μmol/L的维生素C、2.5μmol/L 谷 氨 酸 、40μmol/L 谷 氨 酰 胺（Gln）、10μmol/L牛磺酸等能够显著提高栉孔扇贝的孵化率，降低幼虫滞育率[5]。

Gln为组成生物体蛋白质的特殊游离氨基酸，是核酸、核苷酸、氨基糖和蛋白质的重要前体，参与动物体内谷胱甘肽的合成，能清除自由基和抗氧化损伤，提高胚胎免疫功能和抗逆性[6,7]。李光鹏等[8]发现在小鼠胚胎发育过程中加入适量的谷氨酰胺可以使其顺利通过阻滞期。陈巨星等[9]在研究鲑Oncorhynchus胚胎细胞生长和代谢时也发现，低浓度的谷氨酰胺可以促进胚胎发育。基于Gln的重要作用，本文通过研究在孵化水体中添加Gln对施氏鲟胚胎发育孵化时间、孵化率、畸形率、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）活力、过氧化氢酶（CAT）活力及丙二醛（MDA）含量的影响，以期为添加外源Gln促进施氏鲟胚胎发育及抗逆性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

雄施氏鲟亲鱼体质量15kg，雌亲鱼43kg，人工注射LRHA催熟，剖腹取卵，干法人工授精后的鱼卵用滑石粉脱粘，放入控温的水族箱中孵化。

1.2 方法

1.2.1 试验设计及孵化

采用索莱宝生物有限公司Gln样品（纯度98.5%），按孵化溶液体积加入不同质量Gln，分别调整孵化液中 Gln浓度为 1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L和10mg/L，未添加Gln为对照组。每个孵化箱设3个平行孵化框，每个孵化框中200～300粒受精卵。孵化用水由水质净化系统自动净化，不需换水，孵化水温为20℃，水流量为600L/h，溶氧保持在7.5mg/L以上。观察统计施氏鲟孵化时间、总孵化率、畸形率等。

孵化时间（h）为50%胚胎发育到仔鱼出膜时间间隔；

总孵化率（%）=出膜仔鱼总数（直到全部胚胎孵出仔鱼或中途死亡为止）/胚胎总数×100%；

畸形率（%）=畸形仔鱼数/出膜仔鱼总数×100%。

1.2.2 生化指标的测定

各试验组分别取原肠期、心跳期、出膜前期胚胎20个，将胚胎样品加入3倍体积的PBS缓冲液，4℃下冰浴匀浆5min，3 000r/min离心10min，取其上清液用于测定。总蛋白浓度用考马斯亮蓝法测定。GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力和MDA含量用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

1.2.3 数据处理

结果以平均数±标准差（n=3）表示，用Microsoft Excel 2007和SPSS17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 添加Gln对施氏鲟胚胎孵化的影响

由表1可知，添加Gln能促进施氏鲟胚胎发育孵化。1.0～10.0mg/L Gln各添加组施氏鲟仔鱼出膜时间逐渐降低，孵化时间缩短幅度为2.1～8.7h。添加Gln同时显著提高了施氏鲟胚胎的总孵化率，降低了畸形率。Gln各添加组的总孵化率提高幅度为3.50%～11.86%，畸形率下降幅度为-51.90%～-12.66%。

表1 添加Gln对施氏鲟胚胎孵化的影响（%）Tab.1 Effect of Gln addition on hatching of Acipenser schrenckii（%）

2.2 添加Gln对施氏鲟胚胎GSH含量的影响

由表2可知，添加Gln将增加施氏鲟胚胎各发育期GSH含量。原肠期，Gln各添加组胚胎体内GSH含量提高幅度为4.52%～11.30%。心跳期，Gln各添加组胚胎体内GSH含量提高幅度为13.68%～21.37%。出膜前期，Gln各添加组胚胎体内GSH含量提高幅度为11.39%～18.81%。

2.3 添加Gln对施氏鲟胚胎SOD酶活力的影响

由表3可知，添加Gln同时将增强施氏鲟胚胎各发育期SOD酶活力。原肠期，Gln各添加组胚胎体内SOD酶活力提高幅度为2.72%～6.52%。心跳期，Gln各添加组胚胎体内SOD酶活力提高幅度为9.20%～18.39%。出膜前期，Gln各添加组胚胎体内SOD酶活力提高幅度为10.89%～17.82%。

表2 添加Gln对施氏鲟胚胎GSH含量的影响（μmol/g prot）Tab.2 Effect of Gln addition on GSH level in fertilized eggs of Acipenser schrenckii

表3 添加Gln对施氏鲟胚胎SOD酶活力的影响（U/mg prot）Tab.3 Changes in SOD activity in fertilized eggs of Acipenser schrenckii exposed to Gln

2.4 添加Gln对施氏鲟胚胎CAT酶活力的影响

由表4可知，添加Gln同时将增强施氏鲟胚胎各发育期CAT酶活力。原肠期，Gln各添加组胚胎体内CAT酶活力提高不明显。心跳期，Gln各添加组胚胎体内CAT酶活力提高幅度为4.27%～9.40%。出膜前期，Gln各添加组胚胎体内CAT酶活力提高幅度为6.61%～12.06%。

表4 添加Gln对施氏鲟胚胎CAT酶活力的影响（U/mg prot）Tab.4 Changes in CAT activity in fertilized eggs of Acipenser schrenckii exposed to Gln

2.5 添加Gln对施氏鲟胚胎MDA含量的影响

由表5可知，添加Gln将降低施氏鲟胚胎各发育期MDA含量。原肠期，Gln各添加组胚胎体内MDA含量降低幅度为-7.69%～-15.38%。心跳期，Gln各添加组胚胎体内MDA含量降低幅度为-10.00%～-30.00%。出膜前期，Gln各添加组胚胎体内MDA含量降低幅度为为-19.23%～-26.92%。添加Gln后，施氏鲟胚胎发育各期MDA含量与GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力变化趋势相反。

表5 添加Gln对施氏鲟胚胎发育中MDA含量的影响（nmol/mg prot）Tab.5 Effect of Gln addition on MDA level in fertilized eggs of Acipenser schrenckii

3 讨论

本研究表明Gln添加能明显促进施氏鲟胚胎的发育和孵化效果。Gln添加浓度为1.0～5.0mg/L时，孵化时间缩短幅度为2.1～8.7h。总孵化率提高幅度为3.50%～11.86%，畸形率下降幅度为-51.90%～-12.66%。研究同时表明Gln添加能提高施氏鲟胚胎的抗氧化水平。本研究中1.0～5.0mg/L Gln添加，不同幅度增加了施氏鲟胚胎各发育期GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力和降低MDA含量。

已有的研究表明，随着鱼类早期发育的不断进行，其耗氧率逐渐增加，其代谢强度也在不断增加，代谢过程中产生的活性氧（ROS）会逐渐增多，如不及时清除将会对胚胎产生损伤，进而影响到胚胎的发育[10-12]。Gln添加提高施氏鲟胚胎的抗氧化水平的提高可能与促进施氏鲟胚胎发育有密切关系。抗氧化能力水平增强，可降低胚胎的氧化损伤，使胚胎发育处于健康的发育状态，从而促进施氏鲟胚胎的发育、提高总孵化率和降低畸形率。

ROS是需氧生物生命活动过程中的代谢产物及其衍生的含氧物质。大量产生的ROS会对蛋白质、脂质和DNA等大分子物质产生氧化损伤，正常的机体内，ROS会被抗氧化体系所降解以维持机体的健康状态。这一抗氧化系统内包括有GSH、SOD、CAT等。GSH是具有重要生化性质的硫醇三肽物质，参与体内蛋白质合成、DNA复制和修复、细胞增殖等过程[13-15]。GSH分子中的活泼巯基（-SH），易被氧化脱氢，这使其成为体内主要的自由基清除剂。SOD是动物机体内两种重要抗氧化活性酶，对机体抵御氧化损伤起到重要的保护作用。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它可以把有害的超氧自由基转化为H2O2。而CAT的主要作用是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不致于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH[13-15]。Gln添加提高施氏鲟抗氧化水平，其作用机理可能重要来自于两个方面，一方面通过合成GSH而发挥直接的抗氧化作用。另一方面Gln添加可能间接通过提高SOD、CAT等其他抗氧化酶类的活性，从而增强胚胎抗氧化水平。

本研究为了说明Gln添加对抗氧化水平的影响，测定了施氏鲟胚胎各发育期MDA含量。MDA是氧自由基攻击生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸引发最重要的产物之一，它的产生能加剧膜的损伤，MDA的测定常常与SOD的测定互相配合，SOD酶活力的高低间接反映机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。因此，结合GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力及MDA含量4个指标可以全面了解Gln添加对施氏鲟抗氧化水平的变化情况[13-15]。

Gln添加对施氏鲟胚胎发育前期和后期的抗氧化生化指标的影响差异非常明显，Gln添加对施氏鲟原肠期胚胎GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力和MDA含量变化幅度较小，而心跳期和出膜前期，GSH含量、SOD酶活力、CAT酶活力和MDA含量变化幅度较大。这可能与施氏鲟胚胎发育前期抗氧化酶系统发育还不完善有关，施氏鲟原肠期胚胎表达合成GSH、SOD、CAT的能力较弱，而在后期抗氧化酶系统发育逐渐发育完善，表达合成能力增强。

赵峰等[16]研究表明，水体盐度升高将对施氏鲟幼鱼不同组织抗氧化酶产生影响。本研究中，Gln添加浓度大于10mg/L时，施氏鲟胚胎也呈现总孵化率下降、畸形率升高、抗氧化酶下降和MDA含量升高的趋势。本研究所设的Gln添加量中，5.0mg/L处理的孵化时间最短、总孵化率最高、畸形率最低，各发育期GSH含量最高、SOD和CAT酶活力最高、MDA含量最低。因此，5.0mg/L为Gln应用于施氏鲟胚胎孵化的最佳添加量。