利用AFLP技术检测外源总DNA导入鲫的研究

闫学春，栾培贤，何立川

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

关于外源总DNA的导入技术在动植物改良和新品种创建方面，已有一些研究。Guangyu-zhou[1]将外源总DNA导入棉花Gossypium spp和水稻Oryza sativa、Oryza glaberrima中改变了它们的遗传性状；丁明忠等[2]将大豆 Glycine max（Linn.）Merr总 DNA直接导入玉米Zea mays Linn.sp.中获得优质高蛋白玉米；胡文明等[3]将玉米的总DNA导入小麦Triticum aestivum L.中，提供了新的种质资源，有利解决小麦遗传基础狭窄问题；王德兴等[4]将小麦总DNA导入向日葵Helianthus annuus选育自交系中，获得了品质优良的新品种；闫学春等[5-7]利用显微介导远缘杂交技术分别将中国对虾Fenneropenaeus chinensis和河蟹Eriocheir sinens总DNA导入鲤Cyprinus carpio L.、镜鲤 Cyprinus carpio L.mirror中，分别获得了显微介导中国对虾基因鲤和显微介导河蟹基因镜鲤新品系；刘汉勤等[8]将鲫基因组DNA导入红鲤 Cyprinus flammans（Richardson）的受精卵内，成功构建了转基因鲤新个体；梁明山等[9]将胡子鲇Clarias fuscus总DNA导入长吻Leiocassis longirostris中，使转基因长吻得到了胡子鲇Osteichthyes、Siluriformes、Clariidae 的优良性状；向建国等[10]将鲤Cyprinuscarpio总DNA片段成功导入草鱼Ctenopharyngodon idellus受精卵中，使转基因草鱼获得了鲤的一部分遗传性状；朱新平等[11]成功将鲤基因组DNA导入鲮Cirrhina molitorella受精卵内，对鲮进行了遗传改良，提高了鲮的耐寒性。

鲫Carassius auratus是我国传统的鲤科淡水养殖鱼类，具有易繁殖、养殖周期短等优点。鳜Siniperca chuatsi（又名桂花鱼等）肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，具有优良的遗传资源，利用显微介导远缘杂交技术，将鳜的基因组DNA导入鲫中，以改善鲫肉质的可口程度。本研究将亲缘关系较远的鳜Siniperca chuatsi基因组DNA导入受体鲫中，通过扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism,AFLP）的检测，目的是想要了解外源总DNA直接导入鲫是否有与导入鲤有同样的效果，能否将这些有益的营养特性导入鲫，创造出新的鲫品种。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样本采集

试验用鳜购自哈尔滨市水产市场；试验用鲫取自黑龙江水产研究所呼兰试验站。由黑龙江水产研究所遗传育种与生物技术研究室制备显微介导鳜基因鲫。

1.1.2 引物与试剂

DL2000（DNA Marker）购自大连宝生物工程（大连）有限公司，Taq酶和T4 DNA连接酶购自上海生工生物技术服务有限公司，尿素、AFLP接头和引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。AFLP接头及引物序列见表1。

1.1.3 鳜总DNA的制备

采用一次性无菌注射器在鳜的尾部提取血液0.1～0.2mL，其中加入 20～30μL到含有 800μL裂解液的离心管中，反复颠倒至混合均匀为止。55℃水浴消化，待组织完全裂解后取出。加入2倍的酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1混合液抽提2次，然后加入RNA酶（终浓度为 20μg/mL）37℃保温 30min，再加入等体积的氯仿∶异戊醇=24∶1混合液抽提1次。最后加入2倍体积的冷冻无水乙醇沉淀，再用70%的冷冻无水乙醇洗涤沉淀1次，自然干燥后加入1/10 TE （Tris-HCl 0.02M，EDTA 0.02M，pH=8.0）溶解。再用物理方法打断大片段DNA，将样品DNA稀释至终浓度为200ng/μL，-20℃保存备用。

表1 AFLP接头及引物序列Tab.1 Adapter of AFLP and Primer sequence

1.1.4 显微介导鳜基因鲫DNA提取

试验鱼DNA提取参见闫学春等[12]，剪取鳍条，放入裂解液中，55℃消化，酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）混合液抽提，无水乙醇沉淀，TE溶解，4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 显微注射

在当年的4—6月鲫的繁殖期，选性成熟的亲鱼，经人工催产后，采集其质量高的卵子和精液。为有效利用鱼卵和延长显微注射时间，每次只从冰箱中取少量精、卵混合受精，剩余的精、卵存在4℃冰箱中保存。将鳜的总DNA用显微注射器注射到鲫受精卵的核区附近，注射量在1nL左右。共导入鲫受精卵2 000余尾，获得试验鱼400尾，放入466.7m2池塘饲养（鱼苗从平游到长成当年鱼种，依次投喂丰年虫、大型浮游动物、破碎料和颗粒饲料）。用这种方法保存的精、卵，可使用6～8小时，保证一天都能有充足的精、卵进行导入外源基因研究工作。

1.2.2 AFLP双酶切

酶切组合为Mse I/EcoR I，建立20μL反应体系（10×NE Buffer4 2μL，BSA 0.2μL），37℃水浴酶切2h后，立即65℃灭活20 min。

1.2.3 AFLP接头的制备和连接

用单链寡核苷酸制备双链接头，使Mse I接头序列终浓度为50μM，EcoR I接头序列终浓度为5μM。94℃变性，缓慢冷却至10℃，退出PCR程序，完成双链接头的制备。

1.2.4 AFLP预扩增反应

建立20μL预扩增体系。反应程序为：94℃30s，56℃1min，72℃1min，20个循环，最后72℃延伸7min。

1.2.5 AFLP选择扩增反应

将预扩增产物用无菌去离子水或1/10 TE稀释10倍作为选择扩增的模板。建立25μL选择扩增反应体系。反应程序：94℃30s，65℃30s，72℃60s，13 个循环；每个循环复性温度降低0.7℃，94℃30s，56℃30s，72℃60s，23 个循环。

1.2.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

用6%的变性聚丙烯酰胺凝电泳检测选择性扩增产物。制胶，点样，变性后的PCR选择扩增产物点5μL即可。待溴酚蓝指示剂电泳出凝胶时结束电泳。采用Sanguinetti银染法[13]进行银染，照相，分析。

1.2.7 目的条带回收测序

将差异性条带挖出转移至0.5mL离心管中，加20μL 无菌水，65℃水浴 40min，12 000 r/min 离心10min，取以上清液作模板，用原来选择扩增引物进行PCR再扩增，PCR程序与AFLP选择扩增程序相同，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖电泳DNA回收试剂盒回收目的条带回收，测序。

2 结果与分析

2.1 显微介导鳜基因鲫基因组DNA提取结果

DNA定量分析仪测定表明，提取的显微介导鳜基因鲫基因组DNA OD260/OD280均在1.8～2.0之间，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图1）也显示DNA条带清晰，可用于AFLP后续实验。

2.2 AFLP扩增结果

图1 显微介导鳜基因鲫基因组DNA琼脂糖电泳结果Fig.1 Agarose electrophoresis of the micro-injected exogenous Siniperca chuatsi gene crucian carp genomic DNA

以鳜基因组DNA为阳性对照，以普通鲫基因组DNA为阴性对照。对118尾显微介导鳜基因鲫的AFLP检测表明，在15对AFLP引物中，有2对AFLP引物在48尾显微介导鳜基因鲫中扩增出了和外源鳜基因相同而对照鲫没有的带，阳性率为40.67%。图2是其中的5对引物对部分显微介导鳜基因鲫的AFLP扩增电泳图，箭头所标示的就是供体基因片段。其中引物E-ACA/M-CAC在1个位点上扩增出5个供体基因片段，而引物E-AAC/M-CAG在2个位点上扩增出10个供体基因片段。

图2 显微介导鳜基因鲫E-ACA,M-CAC引物扩增电泳Fig.2 Agarose electrophoresis of E-ACA and M-CAC primers amplification in the micro-injected exogenous Siniperca chuatsi gene crucian carp

图3 显微介导鳜基因鲫序列与鳜供体基因序列比对结果Fig.3 Sequence alignment of micro-injected exogenous Siniperca chuatsi gene crucian carp and donor Siniperca chuatsi

2.3 显微介导鳜基因鲫目的条带测序结果

为进一步找到精确的遗传证据，在AFLP试验结果中，对其中5尾阳性显微介导鳜基因鲫扩增出来的与外源供体鳜基因相同的带，而鲫中没有的条带进行回收。回收产物浓度均为30ng/μL，经琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测，符合测序规格的样品测序（图3）。结果显示，阳性显微介导鳜基因鲫均含有供体基因目的片段。

3 讨论

DNA分子标记是直接反映种群或个体间基因组DNA间的差异，获得差异特征的DNA片段。扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）标记[14]可以快速、简单、稳定地得到来源于不同材料的DN A指纹图谱[15]，可以扫描一个物种的全基因组，而不需要了解被研究物种的DNA序列。这是因为AFLP标记所显示的限制性内切酶酶切片段的长度多态性，是由选择性扩增基因组DNA酶切片段产生。在检测基因组DNA时，这种多态性是以扩增片段的长度不同而检测出来，每次反应产物的谱带在50～100条之间，一次分析可以同时检测多个位点，多态性极高，信息量大，产生的标记数目多，分辨率高，结果可靠，是快速检测鱼类基因组DNA的好方法。近年来，AFLP技术也逐渐用于检测转外源基因组DNA。姬生东等[16]利用AFLP分子标记技术检测导入外源玉米DNA的苜蓿Medicago sativa Linn，在苜蓿中筛选到差异条带数，证明由离子束介导外源DNA导入可以引起受体苜蓿基因组DNA发生变异。闫学春等[5-7]利用AFLP分子标记技术，在受体鲤（镜鲤）中均检测到来自供体中国对虾（河蟹）基因组DNA，证明受体鲤（镜鲤）中含有供体基因片段。本研究中，在显微介导鳜基因鲫的AFLP指纹图谱中扩增出鳜基因片段，从分子水平上验证鳜基因已经成功导入受体鲫中，随后对这些目的DNA片段回收、克隆、测序，显微介导鳜基因鲫的序列与鳜的序列进行比较，发现碱基序列有高度的同源性，更进一步验证鳜供体基因组已经成功导入受体鲫中。检测目的DNA序列是否源于鳜DNA，为显微介导外源总DNA导入技术提供更确凿的分子证据。

本研究采用显微介导远缘杂交技术，尝试鳜基因组DNA与鲫基因组DNA的超远缘基因杂交，利用AFLP技术测出了显微介导处理的鲫含有供体基因DNA片段。分析显微介导鳜基因鲫的多态性，以期为显微介导外源总DNA片段的导入，创制鲫新种质技术提供理论数据。在AFLP实验中，对提取实验鱼DNA的质量要求很高，实验的成功率在很大程度上取决于模板DNA的纯度，即AFLP成功的关键要有高纯度的模板DNA[17]。在AFLP双酶切实验步骤中，可以使酶切中的限制性内切酶的活性发挥到最大化。高纯度的模板DNA是关键，它可使酶切更加充分，酶切结果才更加符合后续实验的要求[18]。所以，在模板DNA的提取过程中必须严格按照实验步骤进行，提取出符合实验要求的无蛋白质和RNA杂质污染的高纯度模板DNA，以保证后续实验的顺利开展。

显微介导鳜基因鲫是在鲫中导入了鳜的基因组DNA，两个物种的杂交存在于基因组水平，而非传统意义上的精卵细胞杂交。检测表明，在受体鱼中明显出现供体的DNA片段，根据周光宇等[19]提出的DNA片段杂交假说，这种带有部分亲和的远缘物种的结构基因、调控基因的杂交DNA片断，即部分与母本同源的DNA片断有可能重组进入母本，使杂种性状出现变异，说明这种基因组杂交的方法是可行的。目前，水产生物转基因所需的优异基因资源非常有限，这也是限制利用功能基因改善水产生物品质的主要问题。孙晓波等[20]将辣椒Capsicum annuum L.花粉中高赖氨酸蛋白基因Cflr导入小麦Triticum aestivum L.中，检测结果显示阳性；朱吉等[21]的研究结果表明，湖南猪Sus原发性心肌症相关蛋白5基因（CMYA5）的多态性与猪肌肉品质性状相关；施培松等[22]开展了匙吻鲟Polyodon spathula脂肪酸合成酶（FAS）基因的克隆及FAS基因mRNA在鱼不同组织肌肉中的表达研究，发现在肝脏等10种组织中均检测到FAS基因mRNA的表达，而在肝脏中的表达量最高；孙志鹏等[23]开展了鲤Cyprinus carpio L.脂肪酸合成酶基因的克隆与表达分析，发现FASN基因在鲤脑组织中表达量最高。随着对水产生物品质育种的逐渐重视，以及水产生物基因组测序和生物信息学在水产生物基因组结构和功能研究的广泛应用，从与鲫品质相关的功能基因方面研究显微介导鳜基因鲫与普通鲫的不同，将有助于深入了解其肌肉品质的差异和更加深入的认识脂肪酸、氨基酸等一系列代谢过程[7]。至于影响鲫肌肉的品质的基因，即鳜基因在受体鲫的精细调控机制还有待进一步研究。