转录因子Twist与Snail在胎盘植入孕产妇胎盘中的表达及其与上皮间质转化关系

陈先侠，王海霞，卢晓倩，蒋晓敏，李 兵，吕红梅

胎盘植入(placenta accreta)是一种较为严重的妊娠并发症，指胎盘的绒毛滋养层细胞不同程度的侵入子宫肌层。近年来，随着孕妇剖宫产次数和人工流产次数的增加，胎盘植入的发病率显著增高[1]。胎盘植入可引起严重不良妊娠结局，危及孕产妇和胎儿的生命。目前，子宫因素(子宫蜕膜、肌间血管重塑障碍)和滋养细胞侵袭能力增强是影响胎盘植入发病的主要因素[2]。在某些生理和病理情况下，上皮细胞可以向间充质细胞转化，即上皮间质转化(epithelial- mesenchymal transition，EMT)，是肿瘤形成、肿瘤浸润转移和恶性发展的关键环节[3]。转录因子Twist和Snail基因最先在果蝇中被发现，与胚胎生长发育中细胞迁移调控相关，是EMT最基本的转录因子，具有癌基因的特征，在恶性肿瘤中呈现高表达，早期参与调控EMT，影响肿瘤细胞的迁移和侵袭[4]。Twist和Snail基因参与EMT调控，对胚胎发育和肿瘤的转移发挥重要调控作用，而胎盘植入发病中，滋养细胞向子宫内膜的侵袭类似于肿瘤细胞具有的迁移和侵袭特点，同时，在EMT中，波形蛋白(Vimentin)是最为重要的一种基质形成的弹性蛋白[5]。该研究通过检测Twist、Snail在正常胎盘和绒毛植入胎盘组织中的表达，探讨Twist、Snail与滋养细胞侵袭性的关系，以及EMT在胎盘植入中联系，旨在进一步认识胎盘植入发病机制。

1 材料与方法

1.1病例资料178例胎盘组织为2013年1月～2017年12月在医院定期产前检查和分娩的孕产妇，其中正常对照者42例(对照组)，136例胎盘植入孕产妇(胎盘植入组)分娩后均经两名病理科医师独立阅片确诊，参照文献[6]中华医学会《胎盘植入诊治指南(2015)》的植入程度分组：分轻度组(47例)，即胎盘粘连，胎盘绒毛植入侵及子宫肌层；中度组(45例)，胎盘绒毛植入深层≥子宫肌层1/2，但未侵及子宫浆膜层；重度组(44例)，即穿透性胎盘植入，胎盘绒毛植入穿透至子宫浆膜层，可侵及子宫外膀胱或直肠等邻近组织。两组一般情况见表1。与对照组比较，胎盘植入组孕产妇的年龄增大，妊娠次数和流产次数增多，分娩孕周较小(P<0.05，P<0.01)。纳入该项研究的孕产妇均排除围产期心肌病、妊娠期高血压、糖尿病和胎膜早破等病史。对照组和胎盘植入组孕产妇对本次研究胎盘标本收集处理均知情，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本和试剂 胎盘娩出后，迅速取胎盘母体面的胎盘组织2块(约1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm)，取材时，正常组选取母体面胎盘中间带部位，胎盘植入组选取粘连或植入部位，注意避开出血、坏死、钙化处。用于Western blot检测的一块组织迅速置于-80 ℃冰箱保存备用；另一块标本常规处理制备石蜡切片，进行免疫组织化学检测，标本固定于10%福尔马林溶液。主要试剂包括：兔抗人Vimentin多克隆抗体、羊抗人Twist多克隆抗体、羊抗人Snail多克隆抗体、羊抗人β-actin多克隆抗体均购自美国Santa Cruz生物技术有限公司；即用型SP免疫组化和二氨基联苯(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

表1 两组孕产妇的一般临床资料比较

1.2.2免疫组化检测Twist、Snail蛋白表达和结果数量判定 采用免疫组织化学SP法检测蛋白表达，操作步骤严格按照使用说明书进行。胎盘组织常规脱水、石蜡包埋，厚4 μm 连续切片，烤片、脱蜡、微波抗原修复，山羊血清封闭，滴加一抗(Twist，抗体稀释度为1 ∶100；snail，抗体稀释度为1 ∶150)50 μl，4 ℃孵育过夜，冲洗后滴加生物素标记的二抗(1 ∶200 稀释)50 μl，滴加DAB工作液显色，苏木精复染，中性树胶封固。以PBS 代替一抗为阴性对照。利用Nikon 4500显微镜摄片，Twist、Snail表达阳性结果为细胞质或胞核染成棕黄色，每张切片随机选取5个×200倍视野，计数阳性染色细胞数。

1.2.3Western blot分析Twist、Snail蛋白表达 取出低温保存的胎盘组织，在玻璃匀浆器中，加入1%体积分数的RIPA裂解液进行匀浆，冰水中超声破碎，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清提取蛋白，应用BCA法进行蛋白质定量，蛋白样品煮沸变性，SDS - PAGE电泳，分别加入羊抗人Twist 、Snail一抗(均为1 ∶1 500稀释)，蛋白质湿法转移至硝酸纤维素膜，生物素化兔抗羊二抗(1 ∶2 000稀释)，室温孵育2 h，ECL化学发光法显色，Image J凝胶成像分析系统扫描成像，测定目标条带的光密度值，以β-actin为内参，比较同一胎盘组织目标条带与β-actin的光密度值，进行半定量分析。

1.2.4EMT检测和相关性分析 采用免疫组化染色SP法显示胎盘组织中Vimentin蛋白表达，并与转录因子Twist、Snail蛋白表达结果进行相关性分析。免疫组化染色方法和结果判断与1.2.2步骤相同。组织为前述两种转录因子连续切片的邻片，观察并分析各组免疫组化染色切片结果图像。

2 结果

2.1胎盘组织中Twist、Snail蛋白的表达情况免疫组化SP染色结果显示，Twist、Snail 阳性染色结果显示胎盘的绒毛细胞或平滑肌细胞等细胞质或细胞核有棕黄色颗粒沉着，对照组胎盘组织中Twist(图1A)、Snail(图2A)表达较弱，胎盘植入组织中Twist、Snail表达明显增强，且随着胎盘植入程度的加重，即Twist、Snail表达由胎盘粘连的轻度组(图1B、2B)到胎盘植入的中度组(图1C、2C)，再到穿透性胎盘植入重度组(图1D、2D)呈逐渐增强趋势。采取南京大学捷达80i软件计数阳性细胞数，结果见图3，与对照组阳性染色细胞数比较，胎盘植入组阳性细胞数显著增多，且随着胎盘植入程度的加重，增多趋势有显著性(P<0.05，P<0.01)。

图1 胎盘母体面组织中Twist蛋白表达 ×200

2.2Westernblot法检测Twist、Snail蛋白表达Western blot法检测各组胎盘组织中Twist、Snail蛋白，与对照组胎盘组织比较，随着绒毛植入程度的增加，即由轻度胎盘粘连到中度胎盘植入，再到穿透性胎盘植入，胎盘组织中Twist、Snail蛋白灰度呈升高趋势。灰度比值Image J软件半定量分析显示，胎盘植入组胎盘组织中Twist /β-actin、Snail /β-actin显著高于对照组胎盘组织中Twist /β-actin、Snail /β-actin。见图4。

图2 胎盘母体面组织中Snail蛋白表达 ×200

图3 胎盘母体面组织中Twist、Snail蛋白阳性细胞表达情况

2.3胎盘组织中Vimentin蛋白表达及其与Twist、Snail蛋白表达的相关性免疫组化SP染色结果显示，Vimentin蛋白阳性染色结果显示胎盘细胞间质中有棕黄色物质沉着，对照组表达较弱(图5)，胎盘植入组136例中，102例Twist表达阳性，其中91例Vimentin阳性表达，与Twist蛋白呈正相关性(r=0.180，χ2=7.682，P=0.006)。Snail蛋白Vimentin蛋白表达随着胎盘植入程度的加重呈逐渐增强趋势，97例Snail蛋白表达阳性中，有82例Vimentin阳性表达，与Snail蛋白呈正相关性(r=0.154，χ2=5.551，P=0.018)。

图4 Western blot检测胎盘组织中Twist、Snail蛋白表达

图5 胎盘母体面组织中Vimentin蛋白阳性表达 ×200

3 讨论

高血压和产科性出血是孕产妇最为严重的不良妊娠，导致严重产科性出血的主要因素是胎盘植入[1]。研究[7]显示，孕产妇胎盘植入是发生严重不良妊娠结局的独立危险因素。胎盘植入是指部分或全部绒毛侵及子宫肌层，根据植入的不同程度，可分为胎盘粘连、胎盘植入和穿透性胎盘植入3种类型；妊娠期间，滋养层细胞增殖、迁移进入绒毛间质中，类似于肿瘤细胞的侵袭性。本组研究和以往研究类似，与正常孕产妇比较，胎盘植入组孕产妇存在年龄增大、妊娠次数和流产次数增多、分娩孕周减小的特点。

转录因子Twist具有癌基因作用，在多种恶性肿瘤中高表达，引起肿瘤细胞早期转移；而转录因子Snail 不仅调控肿瘤细胞迁移，而且与肿瘤细胞侵袭性密切相关[8]。在正常孕妇胎盘形成过程中，胎儿的丛密绒毛膜进入母体的基蜕膜，从基蜕膜的毛细血管间隙获取营养，进行母胎间的物质交换；而胎盘植入孕妇胎盘形成过程中，滋养细胞向子宫平滑肌间结缔组织和浆膜下浸润，细胞间连接作用降低甚至缺失，侵袭能力增强是导致胎盘植入发病的主要因素[9]。本研究通过免疫组化SP法和Western blot实验均证实，与正常对照组胎盘组织比较，胎盘植入组胎盘组织中Twist、Snail蛋白表达明显增强，且随着绒毛植入程度的增加， Twist、Snail蛋白表达呈上升趋势，表明转录因子Twist、Snail参与胎盘植入的发生和发展过程，故两种蛋白的表达升高可能参与胎盘植入发病。

在恶性肿瘤发展过程中，EMT是指上皮细胞转化为间充质细胞，表现为细胞表型改变，上皮细胞间黏附功能降低，细胞极性消失，运动和迁移功能上升。诱导EMT 的转录因子如Twist 与Snail表达上调，结缔组织间充质中表型标志物波形蛋白(Vimentin)表达上调，Vimentin是组成细胞骨架的中间丝蛋白家族成员，表达于各种间充质细胞来源的细胞中，为间充质细胞及其来源肿瘤的特异性标志物[10]。转录因子Twist、Snail是EMT中关键的调控因子，两者的表达升高引起细胞间连接作用下降，上皮特性减弱，间充质细胞表型增强，促进EMT 发展，最终细胞迁移侵袭能力增强。本研究采用免疫组化检测显示，Vimentin蛋白阳性在正常组表达较弱，而胎盘植入组织表达升高，且有随着胎盘植入程度的加重而逐渐增强趋势。采用Spearman相关性分析显示，胎盘组织中Vimentin阳性表达与Twist蛋白、Snail蛋白呈正相关性，表明Twist、Snail 蛋白表达升高可能会促进EMT转化，参与胎盘植入发病，抑制Twist、Snail 蛋白表达可能会降低因胎盘植入导致的严重不良妊娠结局。