山东茶园土壤几丁质降解菌的分离、鉴定及产酶特性研究

傅嘉敏，刘腾飞，韩晓阳

(l. 山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东 泰安 271018；2. 山东省果树研究所，山东 泰安 271000)

2017年山东省茶园面积已达2.7×104hm2，茶产业在推动乡村振兴战略、发展农村经济等方面发挥着重要作用。近年来为了满足市场需求，茶农在管理过程中施用大量化肥，影响土壤环境，降低茶叶品质，对茶叶品质安全及农业生态环境安全造成严重威胁[1]。针对农业生产上施肥用药不科学、不合理现象，国家制定了“双减”项目，通过推进减肥减药，逐步改善土壤理化环境，以提高农作物品质。因此，具有特殊功能性的新型菌肥是未来农业发展的方向。

几丁质广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中[2]，其在农业、食品、医药等方面应用十分广阔，主要是通过微生物分泌几丁质酶来进行降解[3]。目前，在细菌、真菌、放线菌中都发现许多具有降解几丁质功能的菌株，譬如环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、红色链霉菌、米曲霉等[4-9]。滕少辉等[10]筛选出一株几丁质降解菌，经鉴定为鞘氨醇单胞菌。该菌能有效抑制番茄枯萎病菌，对水稻根系发育有较好的促生作用。Mavingui等[11]发现一株具有几丁质酶活性的多粘类芽孢杆菌，该菌能够有效抑制根部和种苗病害。张立阳等[12]从玉米秸秆中分离出一株枯草芽孢杆菌，它对卷枝毛霉、尖孢镰刀菌、米曲霉、黑曲霉的生长具有抑制作用。闫海洋等[13]筛选出一株几丁质降解菌，它对玉米的生物学性状及产量表现出一定的促进作用，增产达13.08%。

本试验拟从山东茶园土壤中筛选出具有降解几丁质功能的菌株，并通过对菌落形态、生理生化、16S rDNA序列的研究，确定菌株的种属，进而对菌株的产酶特性进行研究，为深入研究几丁质的生物降解及菌剂的开发提供菌种支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土样采集 2017年7月采集山东农业大学茶园基地土壤，迅速带回实验室进行微生物的筛选。

1.1.2 培养基 几丁质培养基[14]：蛋白胨10 g，K2HPO40.7 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.3 g，胶体几丁质5.0 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

筛选培养基：胶体几丁质20 g，Na2HPO42 g，KH2PO41 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.5 g，酵母粉0.5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

LB培养基：NaCl 10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的初筛 无菌环境下称取土壤样品，采用梯度稀释法[15]，在分离培养基上进行菌株的初筛。将初筛后的菌株进行保存，供后续试验使用。

1.2.2 菌株的复筛 将初选得到的菌株制备种子液。按照4%的比例将种子液接种到发酵培养基中，培养7 d后进行酶活检测复筛[16]。每个菌株做3次重复测定。

1.2.3 菌落形态及生理生化鉴定 将菌株点接在几丁质培养基中，30℃培养7 d，肉眼观察菌落形态并作好记录。参考细菌手册[17，18]进行生理生化鉴定。

1.2.4 分子鉴定 采用细菌DNA试剂盒提取菌株总DNA。采用细菌16S通用引物(16S-27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S-1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)，并参照文献[19]的反应体系进行PCR扩增。将PCR产物连接到pMD18-T载体中，进行测序。登录NCBI数据库进行菌株序列的比对，并构建菌株的系统发育树，分析菌株的亲缘关系。

1.2.5 SDS-PAGE蛋白聚类 首先将菌株进行富集培养，然后离心，加入缓冲液进行细胞裂解。采用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行电泳分离。阅读PAGE胶上条带信息，对菌株进行聚类分析[20，21]。

1.2.6 产酶条件优化 菌株首先接种于液体种子培养基中，28℃、160 r/min振荡培养至菌液OD=0.05；将种子液按照4%的接种量接种于培养基中进行发酵条件试验。

(1)pH值对几丁质降解菌产酶能力的影响试验：设定pH值为5、6、7、8，温度为25℃，转速200 r/min，设置3个重复，置于振荡培养箱中培养2～3 d，采用DNS法测定酶活性。

(2)温度对几丁质降解菌产酶能力的影响试验：设定温度分别为15、20、25、30、35、40℃六个处理，pH值均为7.0，摇床转速为200 r/min，培养时间2～3 d ，采用DNS法测定酶活性。

(3) 转速对几丁质降解菌产酶能力的影响试验：设定转速为140、160、180、200 r/min，pH值均为7.0，温度30℃，同样设置3个重复，置于振荡培养箱中培养2～3 d，采用DNS法测定酶活性。

(4) 混合菌对几丁质降解菌产酶能力的影响试验：将J4和J17菌株分别培养至菌液OD=0.05，将J4与J17按照1∶1的比例接种4%于培养基中进行产酶试验，与J4菌株和J17菌株单独培养的产酶能力做比较，采用DNS法测定酶活性。

1.3 数据处理

数据采用 IBM SPSS软件进行方差分析，采用Mirosoft Excel 2010 作图。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

2.1.1 初筛 本试验从土壤中分离出20株菌株，并编号为J1—J20(见表1)。经透明圈法筛选出4株几丁质降解菌菌株，分别为J4、J15、J17、J19。

表1 菌株初筛结果

注：“-”为无脱色圈出现。

2.1.2 复筛 (1) 菌株酶活测定：由表2可以看出，J4、J17、J19 3株菌产酶能力存在显著差异。其中J4菌株酶活最高，可达49.31 U/mL，显著高于J17和J19，J17显著高于J19。

(2) 菌株聚类 SDS-PAGE：细胞蛋白电泳可将细菌从蛋白水平上进行区分。由图1可见，菌株J4、J17和J19被分成2大类群。菌株J17、J19属于类群Ⅰ，J4属于类群Ⅱ，说明菌株J17与J19有可能属于同一种属。

综上分析，本试验选择J4和J17作为终选菌株，并做进一步鉴定及产酶特性研究。

表2 菌株酶活结果

图1 几丁质降解菌全细胞蛋白电泳图谱(a)及聚类分析树形图(b)

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌落形态鉴定 由图2可见，J4菌落为淡黄色圆形，其表面光滑，边缘整齐，不透明，菌落呈凸起状。J17菌落为乳白色椭圆形，其表面褶皱，边缘不整齐，不透明，菌落呈凸起状。

图2 菌落形态

2.2.2 菌株生理生化鉴定 菌株J4为革兰氏阴性菌，好氧，V-P阳性，可利用N-乙酰葡萄糖胺、阿拉伯糖、纤维二糖、蔗糖、葡萄糖，脲酶为阴性，能水解淀粉。菌株J17为革兰氏阳性菌，好氧，接触酶阳性，V-P阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖，能水解淀粉。

2.2.3 菌株分子鉴定 经测序检测，菌株J4和J17的序列长度为1 400 bp和1 420 bp。将所得序列进行 BLAST 比对，结果表明，J4属于鞘氨醇杆菌属，J17属于芽孢杆菌属。从菌株系统发育树可知(图 3)，菌株J4与Sphignobacterium亲缘关系最近，菌株J17与Bacillus亲缘关系最近。

图3 菌株系统发育树

2.3 菌株产酶特性研究

2.3.1 pH值对终选菌株产酶能力的影响 由图4a可知，J4、J17菌株随pH值的升高，酶活增加，在pH值7.0时有较高的产酶能力，酶活可达4.31 U/mL和4.34 U/mL，高于或低于pH值 7.0时酶活均有不同程度的下降。表明pH值7.0为J4、J17菌株产酶的最适pH值。

2.3.2 温度对终选菌株产酶能力的影响 由图4b可知，温度影响着菌株的产酶能力。随着温度升高，菌株J4的产酶能力呈直线上升，在30℃时达到最高，之后出现下降，表明在30℃下J4的产酶能力最高。菌株J17在15～20℃产酶能力变化不大，20～25℃产酶能力迅速提升，在25℃时达到产酶能力的最高点。

2.3.3 转速对终选菌株产酶能力的影响 由图4c可知，菌株J4随转速增加，产酶能力有不同程度的增加，在200 r/min时酶活最高；菌株J17随转速增加产酶能力不断增加，在180 r/min时酶活达最高值，之后酶活下降。因此，J4菌株的最适转速为200 r/min，J17菌株最适转速为180 r/min。

2.3.4 混合菌株对几丁质产酶能力的影响 由表3可以看出，J4+J17混合菌株产酶能力与J4、J17单菌株产酶能力相比差异显著，分别高出9%和23%。说明两菌株混合后产酶能力得到提升。

表3 混合菌株对几丁质产酶能力的影响

3 讨论与结论

几丁质广泛存在于自然界中，所降解产物对病害的抑制和植株的生长发育，具有良好的促进作用。滕少辉等[10]筛选出一株几丁质降解菌，经鉴定为鞘氨醇单胞菌。Mavingui[11]和张立阳[12]等分别发现了具有几丁质酶活性的高效菌株，经鉴定均属于芽孢杆菌属，这些菌株对病害的防治以及植株的生长都有良好的促进作用。本试验从山东茶园土壤中筛选出具有几丁质降解功能的菌株J4和J17。通过形态鉴定、生理生化鉴定和分子鉴定，发现J4和J17分别属于鞘氨醇杆菌属(Sphignobacterium)和芽孢杆菌属(Bacillus)。本研究得到的菌株与前人从自然界中筛选到的结果有一致性，说明这两个属中普遍存在着具有几丁质降解功能的菌株。

前人从自然界中筛选到诸多具有几丁质降解功能的菌株，从试验结果来看，各菌株的产酶能力存在较大差别。张立阳等[12]筛选到的Bacillussubtilis，几丁质降解酶活可达3.23 U/mL；孙菽蔚等[22]筛选到的Pseudoaltermonas，酶活可达116.2 U/mL；王海东等[16]筛选到的Aeromonashydrophlilla，产酶条件优化后酶活可达0.39 U/mL。本试验通过对J4和J17产酶条件进行优化，确定了菌株J4在pH 值7.0、温度30℃、转速200 r/min条件下培养，其产酶活性达到最高。菌株J17在pH值 7.0、温度25℃～30℃、转速180 r/min条件下培养，其产酶活性达到最高。两株最高酶活分别可达5.43 U/mL和4.80 U/mL。试验结果与前人有较大差别，有可能与菌株存在的环境、分离筛选所用的底物等方面存在着差异[16]，从而导致酶活差异较大。