基于上转换纳米粒子与金纳米粒子构建荧光共振能量转移体系检测双酚A方法研究

许 宙 鲁士珍 陈茂龙 朱颖越 丁 利 程云辉

(1. 长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114；2. 常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500)

双酚A是一种固化聚碳酸酯塑料和合成环氧树脂的有机小分子物质[1]，其广泛用于食品包装容器、奶瓶、包装材料、餐具和微波炉等的生产[2-3]。但BPA具有不稳定性，酸、碱环境和加热等因素均会导致其迁移至所包装的食品或饮料中[4]，使其广泛存在于环境和食物链。同时，BPA是一种环境内分泌干扰物，可模拟雌激素的作用与雌激素受体结合干扰生物体内的激素代谢[5-6]，从而导致人和动物的生殖系统、神经系统[7]以及免疫系统等异常，甚至有可能诱发癌变[8-9]和威胁胎儿及儿童的生长和发育，使其出现出生缺陷，不孕、女孩早熟和肥胖等问题[10]。

目前，测定双酚A的主要分析方法是高效液相色谱[11]、液—质联用法、气相色谱—质谱法[12-13]、荧光法[14-15]和酶联免疫吸附法[16-17]等，其中常用的分析方法为色谱法和MS技术。这些技术能够实现对双酚A的高灵敏度分析，但需要专业人员操作、资本投入高、样品制备和预处理复杂费时等要求限制了其在双酚A检测中的广泛应用[18-19]，且无法满足目前对检测技术高速度、高通量、高便携性的要求。因此，建立一种样品前处理简单、成本低、灵敏度高的双酚A快速检测方法具有重要意义。

荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)是当能量供体分子的荧光光谱与能量受体分子的激发光谱重叠时，2个荧光分子之间通过偶极—偶极相互作用发生非辐射能量跃迁，供体分子激发态的能量通过分子间的电偶极相互作用转移给受体分子基态，从而使能量供体分子的荧光强度减弱或淬灭、出现荧光寿命缩短，与此相反，能量受体分子的荧光强度增加，荧光寿命延长的现象[20]。荧光共振能量转移是一种均相分析检测技术，具有灵敏度高，选择性好、操作简单方便等优点而广泛应用于食品安全检测领域。传统的荧光供体通常是有机荧光染料，存在吸收光谱较窄，吸收峰和发射峰之间的斯托克斯位移较小等缺陷。而上转换荧光纳米材料是使用近红外光(980 nm或者880 nm)作为激发光源，发射光在可见光区域分布，具有宽广的吸收光谱，斯托克斯位移较大等特点，并可以克服生物组织或者复杂样品自身荧光干扰，降低了检测体系中的信噪比。因此，上转换纳米材料是理想的荧光共振能量转移体系能量供体。

本研究拟利用适配体核苷酸的碱基互补配对作用，驱动适配体功能化AuNPs和适配体互补链功能化UCNPs进行组装，将适配体对BPA的识别过程转化为检测体系荧光发射强度变化，建立高选择性、高灵敏度的BPA检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

YCl3·6H2O(99.99%)、YbCl3·6H2O(99.99%)、ErCl3·6H2O(99.99%)、油酸(OA)、1-十八烯(ODE)、聚丙烯酸(PAA，相对分子量5 000)：北京百灵威科技有限公司；

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(suflo-NHS)：98%，上海麦克林生化科技有限公司；

氢氧化钠、氟化铵、柠檬酸三钠、氯金酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：≥99%，国药集团化学试剂有限公司；

氯化钠、氯化钾：≥99%，广东光华科技股份有限公司；

十二烷基磺酸钠(SDS)：99%，合肥博美生物科技责任有限公司；

实验室用超纯水：18.2 MΩ·cm的Millipore制备；

其他试剂：分析纯，市售；

荧光分光光度计：F96PRO型，上海棱光技术有限公司；

激光发射器：MDL-III-980-2W型，中国长春新产品光电技术有限公司；

磁力搅拌电热套：ZNCL-TS型，河南巩义市宏华仪器设备有限公司；

透射电子显微镜：JEOLJEM-2100型，日本电子株式会社；

紫外可见分光光度计：UV-1800型，日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 水溶性上转换纳米材料的制备 按照Li等[17]报道的合成方法制备油溶性上转换纳米材料：称取YCl3·6H2O 0.236 g、YbCl3·6H2O 0.077 g、ErCl3·6H2O 0.007 g(Ln：78% Y3+、20% Yb3+、2% Er3+；共计1 mmol)加入到100 mL 三颈烧瓶中，加入4 mL OA和15 mL 1-ODE，1 500 r/min 磁力搅拌同时逐渐升温至130 ℃，氮气保护以除去环境中的空气和水蒸气，进一步升温至160 ℃，至混合物形成均一溶液后自然冷却至室温；准确称取0.13 g NaOH和0.13 g NH4F溶于10 mL甲醇中，将上述溶液逐滴加入到三颈烧瓶中，磁力搅拌30 min至反应体系充分混合，随后缓慢加热以蒸发甲醇，再逐渐升温至300 ℃，氮气保护加热1 h后，溶液自然冷却，产品用乙醇从溶液中沉淀出来，乙醇/环己烷(体积比5∶1) 清洗3次，烘干，即得NaY0.78F4:Yb0.2；Er0.02油溶性上转换荧光纳米材料。

油酸包覆的上转换荧光纳米材料由于油酸分子的烃链起疏水作用，材料在水中的分散性极差，需要对该材料表面进行PAA修饰。本研究按照Dai等[21]报道采用配体交换法制备PAA包裹的水溶性上转换荧光纳米材料：10 mL PAA分散在乙醇溶液(～20 mL wt 99.8%)中，5 mL OA-UCNPs分散在氯仿(～10 mL wt 99.8% )，然后将乙醇溶液加入到氯仿中，隔夜搅拌。再用乙醇清洗3次，最后将上转换荧光纳米材料分散在水中。

1.2.2 金纳米颗粒的制备 根据文献[22]记录采用柠檬酸三钠还原氯金酸(HAuCl4)法来合成金纳米颗粒，步骤如下：取超纯水97.5 mL以及质量浓度为0.412% (10 mmol/L)的HAuCl4溶液2.5 mL加入到有磁性搅拌子的洁净锥形瓶中，采用磁力加热搅拌器，搅拌、加热至沸腾，7～8 min 后，加入质量浓度为1%的柠檬酸三钠溶液2 mL，溶液从无色变为酒红色，保持10 min，然后停止加热，但保持原来的磁力搅拌状态；维持15 min后从磁力加热搅拌器上取下锥形瓶，所得酒红色液体即为13 nm AuNPs。

1.2.3 金纳米探针的制备 利用BPA适配体取1 mL制备得到的AuNPs溶液高速离心得到AuNPs沉淀，然后分散在1 mL 10 mmol/L pH 7.4 PBS缓冲液中，加入BPA适配体溶液(DNA1)10 μL，振荡混合后摇床孵育过夜，反应结束后，溶液用12 000 r/min离心15 min，弃上清，保留底部暗红色的AuNPs-DNA1探针，重悬于SDS溶液中，于4 ℃冰箱中储存备用。

双酚A适配体序列5端巯基：5-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCAT-CACGGGTTCGCACCA-3。

1.2.4 上转换荧光纳米探针的制备 称取10 mg PAA修饰的NaYF4：Yb0.2，Er0.02UCNPs(PAA-UCNPs)分散在5 mL 10 mmol/L PBS(pH 7.4)缓冲液中，超声充分分散，加入200 mmol/L EDC和100 mmol/L sulfo-NHS溶液各100 μL，37 ℃摇床活化2 h。之后加入一定量的BPA适配体互补链(DNA2)，在37 ℃摇床中孵育过夜，离心收集材料，用PBS缓冲液清洗3次，将最后得到的核酸适配体互补链修饰的功能化UCNPs(UCNPs-DNA2)分散在0.01% SDS溶液中，UCNPs-DNA2的浓度为2 nmol/L。

互补链5端氨基修饰：5-CCCACCTGACCACCCAC CGG-3。

1.2.5 检测体系的构建 用超纯水配制所需浓度的BPA标准溶液(1.0×10-3，1.0×10-4，1.0×10-5，1.0×10-6，1.0×10-7，1.0×10-8，1.0×10-9mol/L)，各取10 μL加入到制备好的功能化金纳米探针(AuNPs-DNA1)中，室温下振荡孵育3.0 h；离心分离去除未反应的双酚A，水洗3次重悬于500 μL 的0.01%的SDS缓冲液中，制备得AuNPs-DNA1-BPA纳米粒子；向上述溶液中加入500 μL制备好的功能化UCNPs(UCNPs-DNA2)，混合均匀，室温下振荡孵育1.0 h后，用激光发射器980 nm激发检测体系，紫外-可见分光光度计检测其在500～700 nm波长范围内的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

检测原理如图1所示。通过BPA适配体功能化修饰的AuNPs与双酚A发生特异性识别，当检测体系中没有BPA存在时，功能化AuNPs与功能化UCNPs通过DNA杂交作用进行结合；反之，当体系中存在BPA时，BPA会与适配体功能化AuNPs发生竞争性结合，导致功能化AuNPs从UCNPs表面脱落。随着BPA浓度的升高，功能化UCNPs与功能化AuNPs结合形成组装体的程度逐渐降低，使用激光980 nm 激发检测体系，随着组装体组装程度降低，在发射光543 nm波长处特征峰的光强度逐渐增强，据此建立基于FRET原理的金纳米粒子淬灭上转换荧光的BPA检测传感平台。

图1 荧光共振能量转移体系检测双酚A原理图Figure 1 Schematic diagram of FRET sensor for detection BPA

2.2 功能化AuNPs和UCNPs纳米材料的表征

透射电镜分析是纳米材料最重要的表征手段之一，可以直观地反映纳米材料的形貌、粒径和分散性等状态。其中，材料粒径过大易导致聚沉而无法满足检测要求；分散性是该传感器建立的重要条件，直接影响纳米材料的功能化修饰和特异性竞争结合的结果。图2、3是透射电子显微镜(TEM)和水合粒径仪(DLS)对适配体功能化AuNPs和互补链功能化UCNPs的表征结果。从图2可观察到，功能化UCNPs和AuNPs均呈现出良好的分散性，并且颗粒大小相对均匀、一致，其平均粒径分别为120，13 nm。当体系中不存在双酚A时，UCNPs表面的适配体互补链会与金纳米粒子表面的适配体发生特异性结合，如图2(c)所示。

从图3(a)、(b)可观察到功能化UCNPs和AuNPs均呈正态分布，说明2种材料均呈现良好的分散性且颗粒大小相对均匀，其平均粒径分别为92，23 nm，分散性和粒径均满足下一步组装要求。在图3(c)中显示，组装后形成的UCNPs-AuNPs复合物的平均粒径分布范围为30～820 nm，基本对应AuNPs-DNA1和UCNPs-DNA2数据的加和，说明功能化修饰的UCNPs-DNA2和AuNPs-DNA1通过碱基互补配对原则发生DNA杂交，形成UCNPs-AuNPs复合物，满足形成FRET原理中缩短供受体之间的空间距离的要求。

2.3 BPA测定

通过BPA与AuNPs表面的适配体特异性结合改变检测体系中功能化纳米材料组装程度，考察不同浓度的镉离子对应荧光强度的影响，由图4可知，在检测体系中加入BPA后，检测体系在543 nm处的特征峰荧光强度逐渐提高。由图5可知，检测体系在543 nm处的特征峰值与BPA浓度之间存在线性关系y=18.967ln(x)+539.36(R2=0.992 3)，检出限为1×10-10mol/L。

图2 功能化UCNPs、功能化AuNPs、UCNPs-AuNPs 复合物的透射电镜图

Figure 2 TEM of functionalized UCNPs, functionalized AuNPs, assembled nanocompositec

图3 功能化UCNPs、功能化AuNPs、UCNPs-AuNPs复合物的水合粒径图Figure 3 DLS of functionalized UCNPs, functionalized AuNPs, assembled nanocompositec

图4 不同BPA浓度对应的荧光发射光谱图

Figuer 4 A typical recording output for the detection of different concentrations of BPA by the developed method

图5 BPA浓度与543 nm处的荧光信号强度的线性关系

Figuer 5 Standard curve of the fluorescence at 543 nm versus BPA concentration by the developed method

2.4 特异性分析

为了评价本方法对双酚A的检测特异性，采用多种BPA结构类似物检验检测体系，如对苯二甲酸二辛酯(DOTP)、己二酸二(2-乙基己基)酯(DEHA)、双酚F双(2,3-二羟基丙基)醚(BFDGE)、双酚A二(3-氯-2-羟基醚)醚(DOA)、双酚F缩水甘油醚(BDFGE)、4-辛基酚(4-OP)进行了分析检测，添加浓度为1 μmol/L，在对照组中添加BPA(浓度为100 nmol/L)，结果如图6所示，1 μmol/L BPA结构类似物回收率均低于5%，说明本试验所构建的BPA适配体传感器具有良好的特异性。

图6 不同BPA结构类似物对传感器的影响

Figuer 6 Different fluorescence response of the aptasensor at 543 nm to BPA and different BPA analogs

2.5 回收试验

为了验证所建立的上转换-荧光共振能量转移生物传感器的实用性，本研究对牛奶和自来水样品进行了加标回收试验。在实际样品中加入不同浓度的BPA，用本研究建立的上转换-荧光共振能量转移生物传感器进行检测，结果如表1 所示，自来水的回收率为95.6%～103.1%；经过前处理后牛奶样品的回收率为91.2%～92.3%，说明本研究构建的生物传感器适合用于自来水和牛奶的分析检测。

表1 实际样品(自来水、牛奶)回收率测定Table 1 Recoveries of BPA

3 结论

本研究利用双酚A适配体功能化金纳米粒子与适配体互补链功能化上转换荧光纳米粒子构建了一种基于荧光共振能量转移原理的双酚A检测方法。方法最低检测限为1×10-10mol/L，该方法相比于传统荧光检测方法可以克服样品中生物组织带来的荧光干扰，且前处理简单快速，能够获得高回收率。为具有生物荧光背景的食品样品提供一种快速检测小分子危害因子的新思路。