嗜热α-淀粉酶热稳定性的决定因素及提高策略

李才明 陈双娣 顾正彪 洪 雁 程 力 李兆丰

(1. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122； 3. 江南大学食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122)

酶是一种具有生物催化活性的蛋白质。通常，在温度高于50～60 ℃时，酶蛋白会发生变性而失去相应的活性，这种在高温下的不稳定性严重影响其应用[1]。然而，嗜热酶作为生物催化剂有着许多独到的优势，包括：① 稳定性提高，贮存、运输成本降低；② 反应效率提高；③ 对反应的冷却系统要求低，利于能耗及成本的降低；④ 在高的反应温度下，能减少杂菌污染；⑤ 在高温下，反应体系黏度降低，有利于传质。因此，嗜热酶的开发已成为当今的研究热点。

嗜热α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)是目前工业上最重要的酶制剂之一，在食品、纺织、医药、造纸等工业中有着十分广泛的应用。作为一种淀粉内切酶，其作用方式是随机切断淀粉或糖原分子内部的α-1,4-糖苷键，使淀粉黏度迅速下降，生成葡萄糖、麦芽糖、低聚糖和可溶性糊精[2-3]。因此，在淀粉的酶转化工业应用中具有潜在的应用价值。一般地，所有淀粉的酶转化都包括糊化、液化和糖化过程。首先，通过加热淀粉水溶液可达到糊化的作用，为了淀粉糊化后能够立即进行液化、糖化反应而避免过长的冷却时间，就需要在较高温度下稳定性较好的淀粉酶。因此，具有特殊耐热性的嗜热α-淀粉酶被广泛地用来满足更高的温度要求，进而促进整个淀粉加工业的发展。另外，嗜热α-淀粉酶作为嗜热酶的典型代表，在嗜热酶的研究、开发及应用中扮演着重要的角色，并有助于探索蛋白质达到极端热稳定性的相关机理。本文主要对嗜热α-淀粉酶热稳定性的决定因素及其热稳定性提高策略进行全面的综述。

1 嗜热α-淀粉酶的来源

嗜热α-淀粉酶有多种来源，包括植物、动物和微生物，并在这些来源的碳水化合物代谢中扮演重要角色。尽管α-淀粉酶分布广泛，但微生物来源的，尤其是真菌的和细菌的α-淀粉酶因其成本、效率、一致性、对产品更少的时间/空间上的要求以及方便确定和优化工艺条件而应用于工业生产中[4]。

在细菌中，芽孢杆菌被广泛应用于嗜热α-淀粉酶的生产以满足工业的需求。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)被认为是嗜热α-淀粉酶的优良生产者，也广泛应用于生产具有不同商业用途的酶。特别是古菌α-淀粉酶与芽孢杆菌α-淀粉酶相比具有极好的嗜热特性，表1列出了部分微生物来源的嗜热α-淀粉酶。

表1 嗜热α-淀粉酶的微生物来源及性质Table 1 Microbial origins and properties of thermophilic α-Amylase

2 嗜热α-淀粉酶热稳定性的决定因素

酶的热稳定性涉及到在高温条件下多肽链的化学特性和空间立体结构的变化，嗜热α-淀粉酶可作为分析热稳定性的模型。有关嗜热α-淀粉酶稳定性的研究不仅有助于对蛋白质稳定性机制的理解，还可以帮助开发适于工业生产中的对热更稳定的酶。

通过同源序列比对，结合定点突变技术分析结构和稳定性方面的关系，揭示了一些导致嗜热α-淀粉酶热稳定性高的重要因素，但并未得到单一的、普遍的机制，而是众多因素综合作用的结果。同时，热稳定性的分子机制随酶的不同也存在差异。然而，一些共有的特征都被认为是嗜热α-淀粉酶热稳定的影响因素，主要包括：① 氨基酸的组成与分布，如嗜热α-淀粉酶中的疏水性氨基酸通常高于中温蛋白酶，这些疏水性氨基酸能增加蛋白质的刚性和疏水性，从而提高嗜热α-淀粉酶的耐热性[20]。② 带电荷氨基酸与不带电荷氨基酸的比率，如相对于Ala、Val、Ser、Thr、Asn，嗜热α-淀粉酶中的Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg含量偏高。③ 严格和紧凑的空间结构。空间结构紧凑，堆积密度增加，导致在一定温度下，嗜热α-淀粉酶较同源嗜温蛋白酶有更低的热运动水平和更小的弹性。④α-螺旋的稳定性[21]15-19。嗜热α-淀粉酶的α-螺旋中一般缺少β-分枝残基(Val、Ile、Thr)，避免了α-螺旋中的蛋白质伸展到更广的区域，可能使嗜热蛋白质具有更强的刚性，从而较其嗜温同源体有更好的抗热能力[20]。⑤ 氢键数目[22-23]。较多的氢键数目，有利于氢键网络的加强，因而嗜热α-淀粉酶表现出更好的耐热性。⑥ 更多的作用力，如离子相互作用、疏水相互作用、二硫键的数量、芳香基团的相互作用[21]20-41。⑦ 金属离子结合位点的存在[24]。来源于B.stearothermophilus的Ca2+-Na+-Ca2+结合位点对其热稳定性有着重要作用[25]。⑧ 去折叠熵值等。影响α-淀粉酶热稳定性的主要因素还包括一些金属离子的存在与否、底物和其他稳定剂的情况等[26]。

来源于B.licheniformis的嗜热α-淀粉酶(BLA)，是一个分子量约58 kDa的单体，存在一中心部位——α/β桶。作为其嗜温同源体，来源于B.amyloliquefaciens的α-淀粉酶(BAA)，有着与BLA近似的分子量。Khajeh等[27]对BLA和BAA进行了序列比对，发现二者存在很高的同源性，达88%。SWISS-MODEL结构模拟结果进一步表明，BAA的3D结构与BLA极为类似，这2种α-淀粉酶的二级结构组成成分也非常相似。通过GETAREA程序计算可获得表面和水解作用，比较结果发现，嗜热BLA的结构较嗜温BAA更灵活。特别地，结构域B的许多突变在一定程度上能够影响BLA的热稳定性，从而使其适应不同温度下的反应。

3 α-淀粉酶热稳定性的提高策略

α-淀粉酶热稳定性包括热力学稳定性和动力学稳定性。热力学稳定性是由酶的稳定态自由能(ΔGstab)和变性温度(Tm，50%蛋白质去折叠时的温度)决定的。动力学稳定性通过在特定温度下酶的半衰期(t1/2)来描述[28]。

嗜热α-淀粉酶与普通嗜温酶相比，它们的碱基序列、酶的三级结构及催化机制相似度很高，但上述因素的微小差异导致了嗜热α-淀粉酶较普通淀粉酶有更好热稳定性。这种差异的存在，为α-淀粉酶热稳定性的提高奠定了基础。目前，α-淀粉酶的热稳定化技术按照原理可分为3种：物理法、化学法和生物法。

3.1 物理法

α-淀粉酶可以通过添加稳定剂来达到增强热稳定性的效果。酶体系中添加稳定剂后，其体系黏度会有所增加，体积排阻效应得到了提高，静电相互作用也会增强，这有利于改善酶所处的微环境，稳定酶的空间结构构象，最终酶的热稳定性往往也因此而提高。常用的稳定剂主要包括糖与多羟基化合物和盐2类。

糖与多羟基化合物，常用的有以下几种：淀粉、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇、纤维素、曲拉通等。在酶体系中加入此类物质，酶分子会因其周边渗透质的排斥而优先被水化，从而酶分子的稳定性得到增强。不同的稳定剂往往对酶有着不同的稳定效果。作者[29]通过将15% PEG1000添加到来源于B.circulans的α-淀粉酶中，发现能将60 ℃的半衰期延长6.5 倍。Yoon等[30]系统性地研究了不同多羟基化合物(如曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯醇)对猪胰腺α-淀粉酶(PPA)、人类唾液α-淀粉酶淀粉酶(HAS)、米曲霉α-淀粉酶淀粉酶(AOA)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(BAA)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(BLA)这几种α-淀粉酶热稳定性的影响，结果发现添加物及其添加量不同时，对不同酶的热稳定性影响结果也存在一定的差异。

盐类物质不同于糖或多羟基化合物，其对α-淀粉酶的稳定原理是：盐的添加引起盐与酶分子非特异性结合现象的发生，减缓酶的变性，从而利于酶热稳定性的提高。其中有些盐类物质可作为酶的辅助因子在维持α-淀粉酶的构象以及保持α-淀粉酶的活性方面扮演着重要角色，例如有些金属离子结合位点(比如Ca2+、Na+等)。因此，对于那些结构中存在金属离子结合位点的α-淀粉酶，往酶体系中加入相应的盐(比如CaCl2、NaCl等)，能对酶起到激活作用或增强其热稳定性。Yadav等[28]通过添加10 mmol/L Ca2+能将变性温度Tm从48 ℃提高至71 ℃，大大增加了α-淀粉酶的热稳定性。Maalej等[31]发现来源于Pseudomonasstutzeri的α-淀粉酶在50 ℃保温1 h后的残余活力只有约20%，而加入2 mmol/L Ca2+时，残余活力能保留80%，说明Ca2+对酶的稳定性有很大的改善效果。

3.2 化学法

化学法主要利用的是化学试剂对酶的修饰作用。α-淀粉酶可以通过加入一定的试剂对酶的特定基团修饰改造来改变α-淀粉酶分子内的作用力，进而改变其结构、功能。化学修饰是α-淀粉酶稳定的一个重要策略，在药物蛋白的修饰中扮演着重要角色，可以有效降低蛋白免疫特性，提高其抗蛋白酶的水解能力，增强热稳定性，从而可以达到延长半衰期的目的。Ismaya等[32]发现利用非极性的酸酐修饰α-淀粉酶能将其稳定性提高18倍。化学修饰对酶热稳定性的影响往往有两方面，没有普遍的适用标准，需根据酶的特点来选择合适的试剂和修饰方法。另外，化学修饰会伴随酶损失，不同批次容易存在差异性[33]。除此之外，化学修饰中所用试剂的安全性问题是在酶的改性方面所面临的最大考验之一。

另外，酶的固定化也是一种提高α-淀粉酶热稳定性的有效策略，就是利用物理或/和化学方法将酶束缚或限制在某一区域，仍能保留酶特有的催化特征，并且能回收重复利用的一种技术[34]。王华等[35]以壳聚糖为载体，戊二醛交联共价固定α-淀粉酶后，其酸碱稳定性和热稳定性均优于游离酶。Defaei等[36]通过离子相互作用将α-淀粉酶固定在磁性纳米粒子上，最适温度从45 ℃升至55 ℃，稳定性得到很大提高，能重复使用10次以上。但由于其工艺技术比较复杂，成本偏高而难以得到广泛应用。

3.3 生物法

蛋白质工程是常见的一种生物手段，α-淀粉酶可以通过该方法来改变其氨基酸序列，从而改变结构或者构象，达到稳定性提高的效果。最初，蛋白质工程主要应用于α-淀粉酶基因在菌株中的克隆表达[12]，最常规的做法是在合适的宿主细胞中克隆和表达出具有良好热稳定性的α-淀粉酶基因。如魏涛等[37]通过将来源于SolfolobustokodaiiStrain 7的高温α-淀粉酶基因ST0817在大肠杆菌中克隆表达，获得具有较强热稳定性和pH稳定性的α-淀粉酶。除了克隆表达外，α-淀粉酶还采用分子生物学手段进行热稳定性的研究。α-淀粉酶除了存在易筛选、负突变株的可用性等优点外，对α-淀粉酶基因也有了深刻透彻的了解，加上其在微生物像枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中发酵的成熟性，成为蛋白质中第一个采用分子生物学手段的研究对象。随着生物技术的不断发展，蛋白质工程已经成为研究的热点之一，一方面被用来研究以增强蛋白质如商品酶制剂的热稳定性，另外一方面也用于研究蛋白结构和功能之间的构效关系。蛋白质工程的技术策略主要有理性化设计和定向进化2种。

理性化设计作为α-淀粉酶分子改造最常用的一种方法，有着良好的前景，对于任何形式的蛋白质工程都具有潜在的研究价值[20]。一般通过以下2种方式进行：① 引入突变；② 通过非共价连接或形成二硫键将蛋白质表面的环进行固定。可以在蛋白质表面局部增加离子来连接非相邻部位，并且不会导致像包埋残基那样产生排斥的范德华力或者造成α-淀粉酶构象不稳定而具有巨大的应用潜力。该技术需以相关α-淀粉酶蛋白分子三维结构为前提，探索α-淀粉酶蛋白结构与功能之间存在的关联性，接着进一步得到α-淀粉酶蛋白分子中与功能相关的氨基酸，最后采用分子生物学手段(如定点或盒式突变)以实现定向改造酶蛋白的理化特性。曾静等[38]通过分析来源于极端嗜热古生菌ThermococcuskodakarensisKOD1的α-淀粉酶ApkA的氨基酸序列，构建单突变体ApkAdsA180K，与D212间形成离子键，于90 ℃下的半衰期较ApkAds延长了2 h。Li等[39]通过多重序列比对将来源于B.licheniformisα-淀粉酶的位于B域长环内187、188位点及附近的269位点进行突变，构建了突变体A269K/S187D/N188T，将其在95 ℃的半衰期提高了9倍，催化效率也提高了1.84倍。但理性化设计需以酶蛋白分子的三维结构为基础，这要求直接测定其晶体结构或者采用生物分析软件进行结构模拟，一定程度上会增加该技术的难度，使过程也变得更加复杂和繁琐化。

定向进化又称非理性化设计，该技术的出现推动了蛋白质工程进入新的阶段。定向进化是指将自然演变的过程在试管中呈现，通过突变、重组使蛋白质的性质往最佳状态进化，以得到具有目标性质的变种体。相比于理性化设计，定向进化的区别在于通过人为模拟自然进化机制进行突变，最大特点在于该过程不需事先了解酶的空间结构和催化机制，可采用随机突变技术，并与快速高通量筛选方法相结合实现酶基因的体外改造。因此，定向进化是一种比定点突变更强大、更有潜力的工程方法。目前，2种定向进化的方法已被开发：① 随机突变方法又称为DNA重组，是将含DNA的酶基因片段通过PCR技术导入到原基因中进行重新组装以得到完整的基因；② 易错PCR技术和DNA重组技术的结合，是在每一次易错PCR循环中筛选出所需要的特性基因，然后通过DNA重组技术获得最好的变体特征。Mabrouk等[23]通过易错PCR得到热稳定性更好的突变体MA-A27，将50 ℃的半衰期从30 min提升至70 min，55 ℃的半衰期从13 min提升至25 min。除了提高酶的热稳定性外，该方法也被广泛用于酶的其他特性改造，如改善酶的底物特异性、提高酶在溶剂中的活性或者提高嗜热酶在酸性条件下的温度等[40-41]。但是定向进化技术还存在以下问题：随机性强，工作量大，费时，成功率低等。

不同行业对不同生理生化特性的α-淀粉酶的需求促进了该酶的研究与发展。酶/蛋白质工程包括将所需的特性整合在适当的基因上，是实现这一目标的很有前途的技术手段。

4 展望

嗜热α-淀粉酶不仅在蛋白质热力学稳定性的基本原理方面，而且在稳定性和催化效率之间的关系方面都激发着人们浓厚的研究兴趣。尽管α-淀粉酶热稳定性的提高已有多种策略，但不可逆变性的过程尚且未知，细菌α-淀粉酶稳定性方面也还存在许多问题。随着高稳定性芽孢杆菌α-淀粉酶的开发，未来α-淀粉酶工程很有可能由稳定性向pH活性以及底物特异性方向转变。由于对α-淀粉酶领域持续不断的深入研究，这些理论和方法也将得到迅速发展，同时更好地应用于构建有着独特性质的α-淀粉酶，如通过修饰酶的遗传特性或定点突变技术来获得更多能满足需要的嗜热α-淀粉酶，同时将不同的酶热稳定性的提高策略进行有机的整合也将体现出其特有的优势，能够达到更理想的稳定效果，也有助于对机理的深入研究。