抑制金黄色葡萄球菌的乳酸菌抗菌肽基因筛选及表达鉴定

任大勇 朱剑威 刘宏妍 于寒松

(1. 吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2. 吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118)

近年来，由金黄色葡萄球菌污染鱼、肉、乳制品等食品而造成的食源性危害日益严重。这与部分金黄色葡萄球菌对抗生素产生了耐药基因，以及菌株分泌的耐热肠毒素在一般化学杀菌剂和高温杀菌处理时并不能有效地去除有一定关系[1-3]。化学杀菌剂和高温杀菌方式在去除大部分有害成分的同时，可能会导致食品品质下降，所以开发天然抗菌物质便成为了研究的热点。

而乳酸菌作为一种益生菌，代谢分泌的酸、过氧化氢和抗菌肽等分泌物通常被认为是安全无害的(generally regarded as safe，GRAS)而被广泛地研究[4]。本课题组在前期试验[5-7]中，从中国东北家庭自制的辣酱、臭豆腐、黏面子等发酵食品中筛选出了7株可以分泌抗菌肽，并对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等具有抑菌效果的乳酸菌，且大部分菌株分泌的抗菌肽具有耐高温、耐酸可以溶于部分有机试剂等特点[8]。

目前，通常使用过硫酸铵等化学试剂从天然微生物中提取抗菌肽[9-10]，但是需要考虑抗菌肽的含量和结构差异，需要选择合适的分离纯化方法，所需成本较高。而Meng等[11]通过毕赤酵母载体成功表达了具有抑菌效果的抗菌肽，与天然微生物中提取抗菌肽相比则更具有成本低和表达量大等优势[12-13]。但由于毕赤酵母具有发酵时间长的缺点，马淑霞等[14]通过pET32表达载体成功表达对革兰氏阴性菌具有良好抑制效果的片球菌素PediocinPA-1，通过大肠杆菌表达载体对抗菌肽进行克隆与表达，更具有培养周期短、成本低的特点。pET28a与pET32同属大肠杆菌表达载体，且pET28a两端含有2个组氨酸标记，更易于表达产物的纯化[15]。所以本研究拟以乳酸菌为原料，通过PCR扩增获得抗菌肽基因，将其与pET28a质粒进行重组转化入BL21(DE3)菌株中，以获得产抗菌肽的基因工程菌株，为抗菌肽的克隆表达途径的拓宽和具体抗菌肽对致病菌抑菌效果的鉴定提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

辣酱、臭豆腐、黏面子、汤子面：东北地区农家腌制；

人体病变组织： ATCC菌种库；

Pfu酶：北京天根生化科技有限公司；

dNTP、DL500 DNA marker、DL15000 DNA marker：宝生物工程有限公司；

Nco I、Xho I、BamH I限制性内切酶，T4 DNA连接酶：美国NEB公司；

胶回收试剂盒：美国Omega公司；

质粒提取试剂盒：爱思进生物技术(杭州)有限公司；

琼脂糖：西班牙Biowest公司；

BL21(DE3)感受态：北京全式金生物有限公司；

Ni柱：上海七海复泰生物科技有限公司；

Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)：北京索莱宝科技有限公司；

硫酸卡那霉素：北京鼎国昌盛生物技术有限公司；

pET28a-DH5α菌株：武汉淼灵生物科技有限公司；

金黄色葡萄球菌(ATCC 6538p)：中国工业微生物菌种保藏管理中心；

植物乳杆菌(L2, T4, T8, L16)、戊糖乳杆菌(L19, S6)、副干酪乳杆菌(H9)：由吉林农业大学食品科学与工程学院食品毒理与安全实验室分离保存。

1.1.2 主要仪器设备

PCR仪：GeneAmp PCR System 9700型，美国ABI公司；

电泳仪：DYY-11型，北京六一仪器厂；

超声波细胞粉碎机：JY92-II型，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株信息与活化 通过传统牛津杯扩散抑菌试验筛选出具有抑菌效果的植物乳杆菌(L2, T4, T8, L16)、戊糖乳杆菌(L19, S6)和副干酪乳杆菌(H9)并在MRS中纯化2次后备用。pET28a-DH5α菌株、金黄色葡萄球菌分别接种于LB培养基内37 ℃，200 r/min振荡培养过夜复苏后备用。菌株信息及培养条件见表1。

表1 菌株信息Table 1 Strains information

1.2.2 抗菌肽基因的扩增与回收 以7株菌株为模板，根据Nation Center for Biotechnology Information(NCBI)中抗菌肽基因序列设计引物(表2)。PCR反应条件：100 μL反应体系中分别添加浓度为10 μmol/L的上下游引物和样品各2 μL，Pfu酶0.5 μL，10 μL的10×E Pfu Buffer，8 μL dNTP Mixture，超纯水补足，并按照如下程序：95 ℃预变性2 min；35个循环(95 ℃ 变性30 s；退火45 s；68 ℃延伸90 s)进行PCR扩增后，在2%琼脂糖中进行电泳验证并进行DNA纯化后于-20 ℃保存。进一步在引物两端添加有保护性碱基，Nco I、Xho I酶切位点和去除终止密码子的引物按照上述条件以保存的DNA片段为样品进行PCR扩增和回收。同时用质粒提取试剂盒对过夜培养的pET28a-DH5α菌株进行提取。

表2 乳酸菌抗菌肽基因的PCR引物信息†Table 2 PCR primer information of antimicrobial peptide gene form lactic acid bacteria

† 当引物添加酶切位点和保护性碱基后，退火温度可适当增加5～10 ℃。

1.2.3 重组质粒的构建与验证 质粒构建过程如图1所示，提取的pET28a质粒与PCR产物使用Nco I和Xho I进行酶切和胶回收处理，按照10 μL反应体系在16 ℃下过夜连接后转入BL21(DE3)感受态中振荡复苏1 h，涂布于含50 μg/mL 硫酸卡那霉素的LB平板上，37 ℃培养18～24 h。挑取正常生长的阳性转化子进行菌落PCR验证，并将其送吉林省库美生物科技有限公司进行测序，测序结果在NCBI中进行比对。

图1 pET28a-抗菌肽的重组表达载体的构建流程图

Figure 1 Construction flow chart of recombinant expression vector of pET28a-antibacterial peptide

1.2.4 抗菌肽蛋白的表达与鉴定 将经验证的阳性转化子，按照1%接入100 mL 含有硫酸卡那霉素(50 μg/mL)的LB培养基中，待OD600达到0.6左右时，加入IPTG诱导表达6 h 后4 000 r/min离心10 min，收集菌体进行破壁处理(pH 7.2的PBS缓冲液重悬菌体，400 W超声4 s，间歇5 s至菌体破碎)。收集胞内蛋白并用8 mol/L尿素进行变性处理，透析复性和Ni柱纯化等处理。纯化蛋白采用牛津杯扩散法对金黄色葡萄球菌进行抑菌测试，同时以氨苄青霉素(50 μg/mL)和水为对照。选取具有抑菌效果的纯化蛋白经Tricine-SDS-PAGE[16]分析，并将目的条带送苏州普泰生物技术有限公司进行nanoLC-ESI-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增抗菌肽基因

由图2可知，7株菌株经PCR扩增后在150～200 bp出现明显的目的条带，再进一步添加相应酶切位点引物对菌株进行PCR扩增并测序后，结果在NCBI中BLAST对比后发现，目的序列与相应的PlnF、PlnE等都具有100%的同源性，表明PCR扩增中碱基未发生突变等现象。这与先前报道[17-19]乳杆菌中含有PlnF、PlnE、PlnE、PlnF等抗菌肽基因相一致。此外，还有研究者[20]在乳酸菌中发现enterocinA、pediocinPA-1等具有抑制金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌的小分子、热稳定的多肽基因，为乳酸菌中抗菌肽基因的扩增提供了理论依据。

2.2 阳性转化子的验证

在LB平板上随机挑选阳性转化子以含酶切位点的引物进行PCR扩增的电泳结果显示，在200 bp附近大部分阳性转化子有清晰的条带(图3)，进一步通过测序比对结果表明相应的重组质粒已正确转入感受态BL21(DE3)中。

2.3 重组质粒的表达与抗菌活性

IPTG诱导表达后破碎收集的各胞内蛋白经Ni柱纯化后对金黄色葡萄球菌均无任何抑菌效果。进一步将胞内蛋白通过尿素变性，透析复性和纯化等处理后，经牛津杯扩散法，以氨苄青霉素(50 μg/mL)和T8为对照发现，经处理后的PlnF蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌圈增至(13.43±0.21) mm，与未经Ni柱纯化的蛋白相比抑菌效果显著增强[图4(e)]，而PlnK的纯化蛋白在牛津杯内有较为微弱的抑制金黄色葡萄球菌能力[图4(b)]，此外PlnJ、 PlnN、PlnE蛋白对金黄色葡萄球菌均无任何抑菌活性。Fangqiang等[21]曾将Pln1基因克隆入pET32a中，并转化BL21(DE3)感受态诱导表达发现，表达的蛋白具有耐酸等特性，并且对革兰氏阳性菌具有较好的抑菌效果。在pET28a克隆表达的PlnE、PlnJ等抗菌肽基因，但可能由于抗菌肽分子量在3～7 kDa，仅具有蛋白质的二级结构，所以可能在外源表达过程中折叠或者螺旋出现错误或者降解[22-23]；以及单纯抗菌肽在pET28a中是以包涵体形式表达，此外在使用变性剂在变复性的过程中[24]，也可能造成抗菌肽失去了活力；并且各个阳性转化子之间出现一定表现差异，蛋白表达的含量也不完全一样。所以将进一步探索密码子优化，融合表达等途径使抗菌肽在胞外或者是以可融性的形式进行克隆表达。综合表达蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌能力，进一步使用Tricine-SDS-PAGE和nanoLC-ESI-MS/MS分析对目的蛋白进行鉴定。

C. 空白对照组 M. DL Marker 图2 7株菌株中不同抗菌肽基因的PCR扩增

Figure 2 PCR amplification results of different antimicrobial peptide genes of 7 strains

1～12泳道. 随机挑选的阳性转化子编号 C. 空白对照组 M. DL Marker 图3 5种pET28a-抗菌肽的阳性转化子的验证Figure 3 Validation of 5 positivetransformants of pET28a-antimicrobial peptides

1. 氨苄青霉素 2. 未纯化的复性蛋白 3. T8上清液 4. 水 5. 纯化蛋白

图4 各表达蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

Figure 4 Inhibitory effect of various expressed proteins onStaphylococcusaureus

2.4 PlnF的Tricine-SDS-PAGE和质谱分析

纯化的目的蛋白经Tricine-SDS-PAGE电泳后，如图5所示，蛋白在7.8 kDa附近出现明显的单一条带。与已知的PlnF的蛋白(约为5.9 kDa)相比，在电泳图上显示的蛋白分子量略大一点，可能是组氨酸等极性氨基酸的存在，造成可见条带与预测大小有一定的偏差。通过nanoLC-ESI-MS/MS分析，并与Uniprot数据库比对，结果表明，目的片段与PlnF抗菌肽具有97.6%的同源性。

1～7道分别为水对照、50 mmol/L咪唑洗脱的PlnF蛋白、100 mmol/L 咪唑洗脱的PlnF蛋白、200 mmol/L咪唑洗脱的PlnF蛋白、空白对照、pET28a-PlnF胞内蛋白、pET28a胞内蛋白

图5 纯化蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳图

Figure 5 Purification ofTricine-SDS-PAGE protein electrophoresis

3 结论

从辣酱、臭豆腐、黏面子、汤子面中通过传统抑菌试验筛选出的具有抑菌效果的7株菌株，经PCR扩增证明以T4、T8为主的几株菌株中含有PlnF、PlnE等抗菌肽基因。进一步在抗菌肽基因两端添加Nco I和Xho I后与pET28a质粒一起在37 ℃进行酶切和DNA回收，在T4连接酶作用下连接过夜后转入BL21(DE3)中，经0.5 mmol/L的IPTG诱导6 h，细胞破碎，变复性和Ni柱纯化后，pET28a-PlnF的蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为(13.43±0.21) mm。但是抗菌肽的原始基因在pET28a中以包涵体形式存在，所以在下一步的研究中将进一步通过密码子优化或融合表达等方式促使抗菌肽基因以胞外分泌的方式在原核大肠杆菌表达载体中进行表达。