甲型H1N1流感病毒RNA定量分析在轻型与肺炎患者中的应用

吉茂礼,程 涛

1.陕西省商洛市中心医院检验科(商洛726000)，2. 陕西省咸阳市泾阳县医院检验科(泾阳713700)

主题词 流感病毒A型, H1N1亚型 逆转录聚合酶链反应 诊断 预测

甲型 H1N1流感是由甲型 H1N1流感病毒引起的急性呼吸道传染病，最初在墨西哥发现。人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感。H1N1病毒毒株包含猪流感、禽流感和人流感三种基因片段。这种病毒可以在人群中互相传染。人感染甲型 H1N1流感后的早期症状与普通流感相似,患者会出现发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等,有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等[1]。感染甲型H1N1的患者中有相当一部分病例病情重，进展迅速，可发展为肺炎、呼吸衰竭、多脏器功能障碍，更为严重者可以导致临床死亡[2]。因此，甲型流感的早期诊断可为其合理预防、合理救治、提高生存率、降低病死率奠定基础。本研究采用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测甲型流感患者咽拭子中H1N1流感病毒的基因表达，进而为H1N1亚型的早期诊断和治疗提供基因依据。

对象与方法

1 研究对象 收集2016年2月至2017年2月期间于两院发热门诊就诊的70例甲型流感H1N1亚型患者及30例普通甲流(普通组)的咽拭子标本，其中女19例，男51例，年龄0～75岁。依据H1N1亚型患者病情状况分为轻型甲流(轻型组)和肺炎甲流(肺炎组)。其中轻型53例，肺炎17 例。甲流感染患者体温在38℃以上，伴有头痛、咳嗽、喉痛、全身酸痛、乏力等上呼吸道感染症状。1例肺炎H1N1亚型甲流感染患者由于呼吸衰竭，抢救无效死亡，其余病例经治疗后痊愈。甲流感染患者经 PCR 核酸检测确诊, H1N1亚型诊断标准符合卫生部甲型H1N1流感诊疗方案[3-4]。甲型H1N1亚型患者分类标准：胸部 X线检查有片状阴影；胸部CT 检查有片状阴影。当出现以上情况之一时判断为肺炎病例，否则判断为轻型病例[2]。本研究得到本院医学伦理委员会的同意以及所有参与者的知情同意。

2 研究方法 ①对所有甲型流感患者的病例建立数据库，登记年龄、性别、临床表现、血常规、胸部 X 线片和胸部 CT。以第一次检查结果为基线资料。②标本采集：采集甲流感染患者咽拭子标本，标本采集后置于密封的带螺旋盖的塑料管内，塑料袋密封，24 h内冷藏运输至咸阳市疾病预防控制中心实验室，采用RT-PCR方法确诊。血常规采用日本西森美康SESMESE-2000 全自动血常规分析仪检测。③甲型流感普通型病毒和甲型H1N1病毒亚型检测：采用Trizol法提取咽拭子中的总RNA，采用RT-PCR技术研究甲型流感患者普通型病毒和甲型H1N1病毒的表达。利用GenBank的信息，根据流感病毒基因数据库，分别选择甲型HlNl流感病毒HA基因和甲型普通流感病毒M基因的核苷酸保守序列(CY083926和CY037368，片段长度分别为152和128 bp)。采用Primer ExPress 2.0软件设计引物，采用β-actin 作为内对照。上游引物(F)和下游引物(R)如下：甲型HlNl亚型流感病毒，F1：5'-TGCTATAAACACCAGccTCCC-3’，R1：5’-GCAATGG CCCCAAATAGG-3’；甲型流感病毒，F2：5’-TTCTAACCGAGGGTCGAAACGT-3’，R2：5’-CCA TCCATGAGAGCCTCAAG-3’；β-actin的引物序列为F3：5’-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3’，R3： 5’-GCCTTCCATCCCTTTGCTTAG-3’。按操作说明书进行RT-PCR。PCR反应体系如下：10 μl 2×Taqman通用的PCR预混物，1 μl 20×miRNA特异性引物，1.33 μl cDNA，7.67μl水；反应条件：95℃变性10 min，95℃、1 5s，60℃、1 min，50个循环，置于4℃ 结束反应。使用荧光定量 PCR仪ABI7500 进行 PCR 扩增。④标准曲线的建立和敏感度测定：分别将甲型HlNl流感和甲型流感外转录的标准品按10倍梯度稀释成108～101拷贝/μl，依次对上述各定量样品进行检测，建立标准曲线，测定敏感度。⑤临床样品检测：用建立的荧光定量RT-PCR方法对疑似甲型流感患者的咽拭子样本进行检测，并采用上海科华生物工程股份有限公司生产的甲型普通型和甲型H1N1流感病毒(2009)RNA检测试剂盒(荧光PCR法)同步检测，对阳性样品进行测序验证。⑥测序验证：提取流感病毒基因组RNA作模板，经逆转录后，进行正反向测序，与美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对验证。

结 果

1 基线资料 0～18岁年龄段轻型患者多于肺炎，而46岁以上年龄段肺炎患者较多(P<0.01)，见表1。轻型组和肺炎组性别比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。肺炎组白细胞总数(WBC)与轻型组比较显著降低，而中性粒细胞分类计数(NEUT)则显著增高，差异均有统计学意义(P<0.01)，轻型组与普通组比较，差异无统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1 轻型和肺炎患者在各年龄段分布对比[例(%)]

注：与轻型组比较,*P<0.01

表2 轻型和肺炎患者性别结构对比[例(%)]

注：与轻型组比较，*P>0.05

表3 各组白细胞总数和白细胞分类结果比较

注：与轻型组比较,*P<0.01

2 各组咽拭子甲流病毒检测结果比较 肺炎组病毒水平与轻型组以及普通组比较显著上调，其差异均有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 各组咽拭子甲型流感H1N1型 和普通型病毒RNA水平比较

注：与轻型组比较，*P<0.01;与肺炎组比较，#P<0.01

3 相关性分析 在甲型H1N1亚型肺炎组中，H1N1病毒表达水平与白细胞总数具有负相关性，而与中性粒细胞分类具有正相关性(r=-0.933，0.912，P<0.01)，见图1、2。

图1 H1N1RNA水平与WBC相关性

图2 H1N1RNA水平与NEUT相关性

4 ROC曲线分析 以肺炎组和轻型组为因变量分析显示，咽拭子中甲型H1N1流感患者病毒RNA的AUC为0.840(95%CI：0.674～0.903，P<0.01)。在最佳临界值处的敏感性和特异性分别为93.2%和77.7%。以上显示咽拭子中H1N1病毒水平在甲型流感病情诊断中有临床意义，见图3。

图3 H1N1在诊断甲型流感中的ROC曲线

H1N1是一种新型流感病毒,可感染人类、禽类、家畜。主要包括人流感、禽流感和猪流感三种流感病毒的核糖核酸和基因片段，同时有非洲猪流感和亚洲猪流感病毒的特征[5]。2009 年 6 月 11 日，WHO 宣布甲型H1N1流感大流行警告级别升至第六级[6]。甲型H1N1 流感患者的初始症状与一般病毒性呼吸道感染相似,流涕、鼻塞、发热、头痛、躯体疼痛,部分患者病情进展迅速,体温大于39℃,可发展为重症肺炎，最终发展为呼吸衰竭、多脏器功能障碍，甚至可导致死亡[7]。荧光定量 PCR 方法已广泛应用于基因表达、病原体检测等诸多研究领域[1]。荧光定量RT-PCR技术在鉴别甲型H1Nl流感、甲型流感中已经被广泛应用，其检测灵敏度达102拷贝/μl,3次重复性试验的相对标准偏差均小于1%，具有很好的灵敏度、重复性以及很强的特异性[8]。张兴权等[9]应用RT-PCR技术研究阿比朵尔体外对2009甲型流感病毒 (H1N1)复制的影响。他们的实验结果显示，当药物浓度为25、12.5、6.25 μmol/L时，H1N1病毒考贝数分别为(2.56±0.83)、(2.33±0.43)、(2.08±0.48)，而对照组H1N1病毒考贝数为(4.66±0.59)。提示阿比朵尔明显抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的复制。以上研究显示RT-PCR技术定量地分析H1N1的RNA病毒表达水平的变化。在随后的报道中进一步印证了RT-PCR技术应用于H1N1甲型流感诊断中的作用。这项实验的RT-PCR病毒定量检测结果显示,过表达Cirp能显著促进H1N1甲型流感病毒的增殖,Cirp+BHK-21细胞在感染H1N1病毒3、9、15、21 h后细胞中的病毒拷贝数分别为对照组的111%、103%、167%和235%，其差异有统计学意义[10]。我们的研究应用RT-PCR技术定量分析了感染H1N1流感病毒初期以及发展为肺炎患者的咽拭子中的病毒表达水平,结果显示肺炎组H1N1病毒HA基因与轻型组以及普通组比较均显著上调(P<0.01),提示随着甲型流感病情的不断进展病毒水平进一步增加。因此,分析甲型流感H1N1病毒RNA表达水平可以判断该疾病的状况,预测H1N1患者病情的进展并且为其治疗提供依据。

研究认为,甲型H1N1流感患者在疾病初期白细胞总数以正常为主。但当病情严重时，肺炎白细胞降低人数显著超过轻型组，而中性粒细胞分类比率明显高于轻型组。以上提示白细胞总数降低和中性粒细胞百分比升高能反映甲型H1N1流感患者病情状况[2]。王威等[11]分析甲型H1N1流感病毒合并重症肺炎患者的血常规结果发现，外周血白细胞多表现为不高或降低，白细胞分类可见淋巴细胞或单核细胞增高，亦有病例表现为中性粒细胞增高为主。我们的研究结果与上述文献报道基本相符。进一步的研究显示年轻患者症状较轻,年龄大(≥46岁)的患者症状较重。本文的相关性分析显示,甲型H1N1流感患者病毒RNA表达量与外周血白细胞总数具有负相关性,而与中性粒细胞比率具有正相关性。ROC曲线的分析结果提示H1N1流感患者病毒RNA水平对于甲型流感病情的诊断有较高的灵敏度、特异度和曲线下面积。因此认为，H1N1病毒RNA表达更有效地反映了甲型H1N1流感的病程进展,检测其水平可用于H1N1的早期诊断及病情预测。