贞丹护肝方对小鼠实验性肝炎的作用

史兴清

(江西省景德镇市第三人民医院药剂科，景德镇 333000)

贞丹护肝方系本院中医科治疗肝炎的临床经验方，由女贞子、丹参、五味子、大黄、蒲公英、茵陈、黄芪、茯苓、甘草等药物组成，具有解毒化瘀，滋阴养肝，益气健脾的功效。该方临床用于急慢性肝炎具有较好的疗效。本研究旨在通过实验验证该方对小鼠实验性肝炎的作用，为其进一步开发应用提供依据。

1 材料

1.1 动物 昆明种小鼠，体重（20±2）g，雌雄兼用。购自南昌大学医学院实验动物科学部。

1.2 受试药物 贞丹护肝方由女贞子6g、丹参6g、五味子 3g、大黄 3g、蒲公英 6g、茵陈 6g、黄芪 6g、茯苓6g、甘草3g组成。以汤剂形式应用，方药调配后煎汤取汁，浓缩成1g/ml（按生药计）浓度的药液，冰箱保存备用。临用时以生理盐水稀释后灌胃给药。给药剂量以方药总量45g/60kg为人用剂量，以该剂量乘以换算系数9后取整数6.0g/kg为小鼠中剂量组用量。取小鼠中剂量乘以1.5倍为高剂量组用量，乘以0.5倍为低剂量组用量。对照药：联苯双酯滴丸，浙江万邦药业股份有限公司生产。

1.3 试剂 四氯化碳：天津市化学试剂一厂；D-氨基半乳糖：Sigma公司；卡介苗(BCG)，兰州生物制品研究所；脂多糖(LPS)，Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒，南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 贞丹护肝方对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响 昆明种小鼠60只，体重（20±2）g，雌雄各半。小鼠适应性饲养1周后，随机分成空白对照组、模型组、贞丹护肝方高、中、低剂量组、联苯双酯组，共6组。除空白对照组动物外，其余各组小鼠灌胃0.2%(v/v)四氯化碳橄榄油溶液，灌胃剂量为0.1ml/10g鼠体重。于造模后24h、48h、71h，贞丹护肝方高、中、低剂量组分别给予贞丹护肝方煎剂9.0g/kg、6.0g/kg、3.0g/kg灌胃，联苯双酯组给予联苯双酯滴丸4.5mg/kg灌胃，空白对照组和模型组灌胃等体积生理盐水，共3次。第72h后，全部动物眼眶取血，4000r/min离心10min，分离血清，测定ALT。

2.2 贞丹护肝方对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的保护作用 取昆明种小鼠60只，体重（20±2）g，雌雄各半。分组同2.1。贞丹护肝方高、中、低剂量组分别给予贞丹护肝方煎剂9.0g/kg、6.0g/kg、3.0g/kg灌胃，联苯双酯组给予联苯双酯滴丸4.5mg/kg灌胃，空白对照组和模型组灌胃等体积生理盐水。每天1次，共7d。末次给药后1h，除空白对照组外，其他各组小鼠腹腔注射D-氨基半乳糖8mg/10g体重，24h后眼球取血，常规分离血清，测定ALT含量。

2．3贞丹护肝方对小鼠免疫性肝损伤的影响 取昆明种小鼠 60只，体重（20±2）g，雌雄各半。 分组同2．1。除空白对照组外其他各组小鼠尾静脉给小鼠尾静脉注射(iv)卡介苗（BCG）浆液 0.2ml/只(含5×106个菌)，致敏后10d，再尾静脉注射脂多糖（LPS）(7.5μg/只)，造成免疫性肝炎模型。 从小鼠尾静脉注射BCG的当天开始，贞丹护肝方高、中、低剂量组分别给予贞丹护肝方煎剂9.0g/kg、6.0g/kg、3.0g/kg灌胃，联苯双酯组给予联苯双酯滴丸4.5mg/kg灌胃，空白对照组和模型组小鼠灌胃等容量的生理盐水，每天1次，连续7d。在尾静脉注射LPS 10h后眼球取血，常规分离血清，测定ALT含量。取血后处死小鼠，取肝左叶固定，常规石蜡切片，HE染色，普通光镜观察组织病理学情况。

2.4 统计方法 实验数据用SPSS 11.5统计软件分析，数据结果均以平均值±标准差（x±s）表示，方差分析，q检验。

3 结果

3.1 贞丹护肝方对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响 实验结果，见表1。表1显示，与模型组比较，贞丹护肝方各剂量组对CCl4造成的急性肝损伤小鼠ALT升高有显著的降低作用(P<0.01)。

3.2 贞丹护肝方对D一氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的影响 实验结果，见表2。表2显示，与模型组比较，贞丹护肝方各剂量组对D-氨基半乳糖造成的肝损伤小鼠ALT活性升高有显著的降低作用(P<0.01)。

3.3 贞丹护肝方对小鼠免疫性肝损伤的影响 实验结果，见表3。表3显示，与模型组比较，贞丹护肝方各剂量组对免疫性肝损伤小鼠ALT活性升高有显著的降低作用(P<0.01)。其中贞丹护肝方中剂量组与联苯双酯组比较也有显著性差异(P<0.05)。

表2 贞丹护肝方对D-氨基半乳糖致急性肝损伤小鼠血清ALT含量的影响(x±s，n=10)

表3 贞丹护肝方对免疫性肝损伤小鼠血清ALT含量的影响(x±s，n=10)

3．4贞丹护肝方对免疫性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响 光镜下观察可见模型组小鼠肝细胞呈脂肪变性，伴有点状坏死，肝组织结构紊乱，有明显炎细胞浸润；贞丹护肝方高、低剂量组和联苯双酯组可见炎细胞浸润，但病理程度较模型组明显减轻；贞丹护肝方中剂量组仅见少数炎细胞浸润，其病理程度最轻。

4 讨论

贞丹护肝方由女贞子、丹参、五味子、大黄、蒲公英、茵陈、黄芪、茯苓、甘草等药物组成。方中女贞子滋养肝阴，富含保肝降酶的齐墩果酸；丹参活血化瘀改善肝脏血流，且有抗肝纤维化作用；五味子为保肝降酶要药；大黄、蒲公英、茵陈清热利湿解毒；黄芪、茯苓益气健脾，扶助正气以增强机体免疫力，诸药合用用，临床用于治疗肝炎具有良好效果。

本实验采用四氯化碳肝损伤、D-氨基半乳糖肝损伤和免疫性肝损伤3种肝炎模型进行试验，结果显示贞丹护肝方对上述3种实验性肝炎均有明显效果。

四氯化碳引起肝损伤模型是肝损伤的经典模型。其特点是能准确反映肝细胞的功能、代谢及形态学变化，重复性好[1，2]。D-氨基半乳糖是肝细胞的磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂，可造成肝脏弥漫性变性、坏死和炎症反应，与临床上急性普通型肝炎的病理变化接近[3，4]，免疫性肝损伤动物模型接近人类病毒性肝炎肝炎发生的病理生理过程，病毒性肝炎引起的肝损伤主要由机体免疫应答反应所介导，当病毒激活机体免疫系统后，产生病毒特异性细胞毒性T细胞。它们不但能与体内病毒起反应而加以杀灭，也会损伤表面带有病毒抗原的肝细胞，导致肝细胞变性肿胀和坏死[5，6]。

ALT是存在于肝细胞浆内的可溶性酶，当肝细胞因各种因素而出现损伤时，细胞膜结构破坏，通透性改变，即可从细胞内逸出细胞外而进人血循环中。此时血清ALT较正常增高，故血清ALT测定是反映肝损伤的灵敏指标[7]。血清ALT水平高低可以反映肝细胞损伤程度。本实验结果显示贞丹护肝方对上述三种实验性肝损伤模型小鼠的ALT升高均有明显的降低作用，表明贞丹护肝方具有明显的抗肝伤作用。本方剂组方用药量偏轻，因其组方思路遵循药皆有“毒”，护肝之剂用量宜轻不宜重的理念。本实验观察到中剂量的贞丹护肝方对于与人类病毒性肝炎肝炎病理变化接近的免疫性肝损伤模型小鼠的ALT升高的降低作用和病理减轻程度有优于对照药物的表现，表明其组方思路有其合理性。本实验显示贞丹护肝方这一中药方剂在治疗肝炎上有其自身优势，值得进一步深入研究。