阻断小鼠Mcl-1表达信号通路对BCG感染的影响

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结核分枝杆菌(MTB)是肺结核(TB)的主要致病菌，以呼吸道为主要传播途径，机体感染结核分枝杆菌后，有10.0%左右的机会发展成活动性肺结核[1]。在2016-2020年的结核病全球结核病战略报告中，中国仍然是30个结核病高负担国家之一，而且正面临着严重的TB、MDR-TB和TB/HIV混合的复杂局面[2]。我国每年因结核病死亡人数是其它传染病总人数的两倍，结核病患者总人数就占全球总数的11%[3]，已被WHO列为需要特别引起警示的国家之一[4]。更严峻的局面是，在2016年全球估算的新发结核病患者中，有410万例未被诊断或未被登记，占同年全球新发病例的39%[2]。漏诊问题不仅与当地诊疗条件及患者本身有关，更与当前所用结核病诊断工具的敏感性和特异性不高等问题有关。因此，尽早诊断潜伏结核感染者，合理应用抗结核药物、控制结核是目前的当务之急。而有研究提出Mcl-1干预是结核潜伏感染防控的一个新方向[5]。故本研究探讨了下调Mcl-1表达的信号通路对BCG感染的小鼠模型的影响，旨在为Mcl-1干预应用于结核病潜伏感染的防控提供更多的方向和理论依据。

1 材料与方法

1.1实验所用菌株，动物及阻断剂 实验所用BCG菌株由中国药物生物制品检定所提供并保存。实验所用小鼠为8周龄的SPF 级(无特定病原体动物)的健康雌性BALB / c小鼠，重约18±2 g，购买于石河子大学实验动物中心。所有关于动物的研究及操作都是经过实验前批准的动物伦理委员会(IAEC)的协议进行的。阻断剂AG490、PD98059和LY29400的规格为5 mg。稀释时将其分别溶解，按试剂说明每支加入0.5 mL的DMSO溶解，稍微摇晃后混合均匀，保存在-20 ℃的冰箱中备用。

1.2主要试剂 10%的胎牛血清购置于美国Thermo公司，PD98059和LY294002购自于美国Sigma公司，1640和DMEM 购自于美国HyClone公司，辣根过氧化物酶(HRP山羊抗兔)购买于北京中杉金桥生物技术有限公司，Tween-80购置于中国天津， TritonX-100购买于中国南京森贝伽生物科技有限公司，Mcl-1 polyclonal Antibody购买于中国北京博奥森生物技术有限公司，其余实验试剂均取自石河子大学病理实验室。

1.3 方 法

1.3.1实验分组 将实验小鼠分为阻断剂组，阻断剂+BCG组和空白对照组，再将AG490+BCG组、PD98059+BCG组、LY294002+BCG组，同时设1 d、3 d、5 d、7 d 共4个时间点，每组每个时间点各设3只小鼠(经过预实验的筛选，时间点的选择是根据Mcl-1的表达水平确定；实验中小鼠数量是根据收集并提取的小鼠腹腔巨噬细胞的数量确定)。阻断剂注射剂量为100 μg/只(注射剂量为实验组前期筛选所得)[6]。

1.3.2结核分枝杆菌感染小鼠模型构建 室温下，在生物安全柜内，用苏通培养液与生理盐水的混合物(0.5 mL;体积比为3∶1)来稀释细菌，取100 μL细菌稀释液涂抹在改良罗氏培养基上。在2～3周后，灭菌接种环取罗氏培养基上生长状态良好的结核分枝杆菌菌落，置于灭菌的磨菌器中，加入少量的含有0.05%的Tween-80的生理盐水充分研磨，使其成均匀浑浊的菌悬液。将细菌悬液按照麦氏比浊法的标准调整至1.0×107菌落(CFU)/毫升。将0.3 mL的菌悬液通过小鼠腹腔注射的方式注射到对应分组的小鼠体内[7]。将感染后的小鼠置于生物安全三级实验室内，IVC 笼具中饲养。在上述时间点将阻断剂AG490、PD98059、LY294002经腹腔注入各组小鼠体内。

1.3.3小鼠腹腔巨噬细胞的收集与提取 在室温在，于上述不同的时间点，将各组小鼠脱颈处死后，用75%乙醇消毒小鼠腹部皮肤，置于超净台中；用无菌的镊子将小鼠下腹部皮肤提起撕开，完全暴露出腹膜；提起腹膜，用5 mL注射器向小鼠腹腔中注入5 mL 1640培养基，反复按摩腹部约10 min，避开肠和脂肪，不同的方向反复抽吸数次并收集所有吸出的腹腔液；将其在1 200 r/min条件下离心5 min，弃上清，PBS液洗涤1次，用DMEM培养液(含10%胎牛血清)将细胞重悬；将收集处理好的细胞接种到6孔细胞培养板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养6 h，贴壁细胞即为小鼠腹腔巨噬细胞[8-9]。

1.3.4TUNEL技术检测细胞凋亡 将各组小鼠于上述不同时间提取并培养小鼠腹腔巨噬细胞。在室温下，将其固定于4%的多聚甲醛(pH 7.4)上，固定约15 min，PBS冲洗3次5 min后，加入0.1% Triton X-100裂解细胞，放在冰上约8 min，PBS冲洗3次5 min。按照TUNEL试剂盒说明操作，凋亡的细胞被TUNEL反应混合物标记出来，TUNEL阳性细胞的数量被观察到。

1.3.5结核分枝杆菌菌落计数(CFU) 将收集提取的腹腔液放入离心机中，6 000 r/min离心20 min，去上清后，加入 1 mL 1% Triton X-100 对巨噬细胞进行裂解，显微镜下观察巨噬细胞全部裂解后(约 10 min)，加入1 mL DMEM 培养基(含 10% 胎牛血清)终止裂解，微型振荡器上振荡混匀约5 min，分别进行10-2、10-3和10-4倍稀释，最终接种于罗氏培养基上。 每个稀释浓度涂抹3个平板，置于 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，21 d后对其菌落进行计数。

1.3.6细胞免疫化学检测Mcl-1的表达 将收集并提取的小鼠腹腔巨噬细胞制成细胞涂片，于4 ℃固定在4%多聚甲醛过夜。PBS洗涂片2次后， 10%的胎牛血清中放置30 min,然后将其在4 ℃抗体孵育过夜。一抗为兔抗鼠Mcl-1，浓度为1∶1 000，二抗为PV6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物，浓度为1∶200。在室温下，使用streptavidinper氧化酶复合物孵育30 min，在黑暗中应用3′-氨基苄苯胺3～5 min。然后用苏木素和伊红(H&E)清洗和复染。两个病理学家进行了免疫组织化学分析，Mcl-1表达的亚细胞位置(核和胞质)被记录在400×放大。参照文献[10]，以阳性和负染色的巨噬细胞计数，并以Mcl-1阳性巨噬细胞的百分比表示。

1.3.7HE染色观察小鼠脏器的变化 在小鼠被处死后，立即将其肺、肝、脾、肾取出，固定于10%的福尔马林中，并用石蜡包埋。经过95%乙醇和无水乙醇进行脱水处理后，用二甲苯进行30 min的处理。然后,石蜡包埋、切片、脱蜡处理后，分别用70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇依次脱水5 min。最后，通过苏木精和伊红着色。显微镜下观察和评估每个图像中存在的炎症水平，炎症区会比非炎症区染得更浓。由于不同的成分，细胞质表现出不同的颜色，从而观察到细胞或组织的组成和病变。

1.3.8小鼠脏器指数测定 在上述时间点解剖小鼠，立即摘取小鼠的肝、脾、肺、肾进行精密称重和测量。脏器指数=脏器重量(mg)/小鼠体重(g)×100%，用脏器的重量与动物体重的比值表示感染脏器的病变程度，即脏器重量指数，则该指数愈大，表示病变程度愈重。

2 结 果

2.1阻断Mcl-1蛋白信号通路促进了小鼠腹腔巨噬细胞凋亡 由于调控Mcl-1表达的信号通路有3条，不同阻断剂对小鼠巨噬细胞凋亡的诱导效果有何差异呢？因此，我们应用TUNEL技术检测了阻断剂AG490、PD98059、LY294002阻断Mcl-1表达的信号通路后小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡率。而在本研究中，由于实验前期研究发现阻断剂处理后第5 d作用效果最好[6]，因此本实验仅分析了阻断剂处理后第5 d对小鼠巨噬细胞的影响。TUNEL结果显示，与对照组相比，BCG感染组巨噬细胞的凋亡率高于对照组，差异具有统计学意义(t=-9.048,P<0.05;图1A;表1)。阻断剂AG490、PD98059、LY294002作用于BCG感染的小鼠后，与未感染组相比，小鼠腹腔巨噬细胞凋亡率均呈现不同程度的升高(t=-7.076,t=-10.662,t=-8.994,P<0.001)，其中阻断剂PD98059的巨噬细胞凋亡率显著高于AG490和LY294002，差异具有统计学意义(F=40.621,P<0.001;图1A)。

注：(A) *P<0.05 为抑制剂处理组与未处理组相比, #P<0.05为感染组与未感染租相比；(B) *P<0.05 为 BCG感染组与PD98059处理的BCG感染组相比图1 抑制剂处理的BCG感染的小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡率和菌落计数Fig.1 Apoptosis rate and CFU in inhibitors treated mouse peritoneal macrophages infected with BCG

2.2阻断剂PD98059作用减少了巨噬细胞内结核杆菌的数量 为了判断阻断Mcl-1表达的信号通路对小鼠巨噬细胞内结核分枝杆菌清除的效果，我们检测了阻断剂PD98059处理后小鼠巨噬细胞内BCG的菌落数量。菌落计数结果显示，与未处理感染组相比，阻断剂PD98059处理后小鼠巨噬细胞内BCG的数量显著减少(t=3.392,P<0.001;图1B)，而且比处理前减少了约58%(处理前为4.3×107，处理后为1.8×107)。

2.3阻断剂PD98059处理抑制了Mcl-1的表达 考虑到阻断剂的应用不同程度增加了宿主巨噬细胞的凋亡率，而 MAPK信号通路阻断剂PD98059比PI-3K和JAK / STAT通路阻断剂诱导更多的小鼠腹腔巨噬细胞凋亡，因此，我们推测MAPK信号通路是结核感染小鼠巨噬细胞时调控Mcl-1表达的主要通路。因而我们通过细胞免疫化学检测了不同阻断剂应用下Mcl-1的表达。细胞免疫化学数据结果显示，感染了BCG的小鼠腹腔巨噬细胞中，Mcl-1的染色呈现阳性表达(表1)。用阻断剂AG490、 LY294002处理的H37Ra感染的小鼠腹膜巨噬细胞中Mcl-1的表达受到抑制，而阻断剂PD98059处理组Mcl-1的表达受到明显抑制。这些结果证实了我们之前的猜测，与BCG感染组相比，阻断剂PD98059处理BCG感染的小鼠腹腔巨噬细胞后，Mcl-1的表达显著降低，其阳性细胞只达到30%(表1)。

表1 抑制剂处理的BCG感染的小鼠巨噬细胞中Mcl-1的表达和凋亡率
Tab.1 The expression of Mcl-1 and apoptosis rate in inhibitors-treated mouse peritoneal macrophages infected with BCG

时间N组别凋亡率(x±s, %)Mcl-1阳性率(%)53Control0.32±0.01053BCG0.80±0.02a10053AG490+BCG0.87±0.02ab9053PD98059+BCG1.28±0.01abc3053LY294002+BCG1.20±0.03abcd70

注:aP<0.05 表示与空白对照组相比；bP<0.05 表示与BCG感染组相比；cP<0.05 表示与AG490+BCG组相比；dP<0.05 表示与PD98059+BCG组相比；eP<0.05表示与LY294002+BCG组相比。

图2 阻断剂AG490、 PD98059和LY294002处理的BCG感染的小鼠脏器组织化学变化Fig.2 Histological changes in BCG-infected mice organs treated with the inhibitors AG490, PD98059, LY294002

2.4Mcl-1信号通路抑制剂处理减轻了结核感染的小鼠脏器的病理损害

2.4.1BCG感染组肺脏 肺毛细血管轻度淤血(图2A-b)；AG490+BCG组肺脏：肺毛细血管淤血(图2A-c)；PD98059+ CG组肺脏：肺毛细血管淤血减轻(图2A-d)；LY294002+BCG组肺脏：肺毛细血管轻度扩张、淤血(图2A-e)。

2.4.2BCG感染组肝脏 中央静脉扩张淤血不明显，汇管区淋巴细胞浸润不明显(图2B-b)；AG490+BCG组肝脏：中央静脉扩张淤血，部分区肝细胞轻度增大，胞浆细颗粒状红染，汇管区少量淋巴细胞浸润(图2B-c)；PD98059+BCG组肝脏：中央静脉轻度扩张淤血，汇管区淋巴细胞浸润减少(图2B-d)；LY294002+BCG组肝脏：中央静脉扩张淤血减轻(图2B-e)。

2.4.3BCG感染组脾脏 脾红髓淤血水肿，散在出血(图2C-b)；AG490+BCG组脾脏：脾红髓淤血水肿、出血(图2C-c)；PD98059+BCG组脾脏：脾红髓轻度水肿、出血减少(图2C-d)；LY294002+BCG组脾脏：脾红髓水肿，出血程度减轻(图2C-e)。

2.4.4BCG感染组肾脏 肾小球轻度淤血(图2D-b)。AG490+BCG组肾脏肾小球和肾间质毛细血管和小静脉部分区扩张淤血(图2D-c)；PD98059+BCG组肾脏：肾间质毛细血管和小静脉扩张淤血减轻(图2D-d)；LY294002+BCG组肾脏：肾间质毛细血管和小静脉扩张淤血，肾小球扩张淤血(图2C-e)。

2.5阻断剂PD98059的应用减轻了小鼠脏器病变程度 为了直观的分析Mcl-1信号通路阻断剂对小鼠脏器的影响，我们还计算了小鼠肺脏、肝脏、脾脏和肾脏的脏器指数。与对照组相比， BCG感染后，各组脏器重量均有不同程度的增加，其中以BCG感染组肺、肝、脾脏器坏死比例减轻最为明显(t=-14.495,t=9.648,t=-11.013,P<0.001;图3)，而肾脏的差异较小(t=-2.45,P=0.04)。当阻断剂 AG490、PD98059、LY294002作用于BCG感染的小鼠模型后，小鼠肺、肝、脾脏器的脏器指数明显减少，而肾脏只有PD98059处理组减少;不同干预方式比较发现，阻断剂PD98059处理组效果最为显著，差异具有统计学意义(F=59.24,F=811.134,F=34.091,F=9.543,P<0.05;图3)。

注：*P<0.05 为抑制剂处理组与未处理组相比, #P<0.05为感染组与未感染组相比图3 阻断剂AG490、PD98059和LY294002处理的BCG感染组小鼠脏器指数变化Fig.3 Viscera index changes of mice in inhibitors AG490, PD98059, LY294002 treated BCG infection group

3 讨 论

MTB是一种典型的细胞内病原体，可以通过多种机制躲避机体的免疫系统的杀伤和清除，从而影响宿主细胞(单核细胞-巨噬细胞)的调控。它还能改变巨噬细胞的功能，抑制细胞凋亡通路的激活，从而使病原体复制、繁殖并生活在巨噬细胞内[1]。因此，有效的控制结核的潜伏感染是目前结核病预防与控制的主要策略。如若能够激活宿主巨噬细胞正常的凋亡过程，则可以有效消除结核的潜伏感染，并能够防止结核病在体内的持续传播。而研究发现抗凋亡蛋白骨髓细胞白血病-1(Mcl-1)与宿主巨噬细胞的这一凋亡过程密切相关[11]。

而近年来，对Mcl-1基因的研究主要集中在与肿瘤相关的疾病[12]。因此，将该基因用于控制结核病感染将是一个新的挑战。在当前的研究中，TUNEL的结果发现，应用阻断剂AG490、PD98059和LY294002抑制Mcl-1的表达后，导致小鼠巨噬细胞凋亡率呈现不同程度的增加(图1)。而且阻断剂PD98059处理后，小鼠巨噬细胞内存活的结核杆菌的菌落数量显著减少(图1)。此结果说明将Mcl-1干预引入到结核病的预防与控制中是可行的，而且它将是很有潜力的一个应对结核潜伏感染的预防和控制策略。

不同的组织和细胞中，调控Mcl-1表达的信号通路有差异，主要通过JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)、MAPK(Mitogen activated protein kinase)和PI-3K(Phosphatidy linositol 3-kinase)等胞内信号通路的激活来调控[13-15]。在本实验中，应用JAK/STAT、MAPK和PI3K信号通路阻断剂下调Mcl-1的表达，都增加了BCG感染的小鼠巨噬细胞的凋亡。但细胞免疫化学的结果显示，当应用MAPK信号通路阻断剂处理BCG感染的小鼠腹腔巨噬细胞时，Mcl-1的表达被明显的抑制了(表1)。此结果说明MAPK通路为结核感染的小鼠巨噬细胞中调控Mcl-1表达的主要通路。

MAPK信号通路其亚族主要包括细胞外调节蛋白激酶1/2 (ERK1/2)，P38，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和ERK5等[16]，多种细胞因子诱导Mc1-1的转录上调都依赖于MAPK的活性[17]。PI3K(磷脂酰肌醇激活) 信号通路通过影响下游多种效应分子发挥其抗凋亡作用[18]。JAK/STAT信号转导通路阻断剂AG490可阻断多种细胞因子引起的JAK2/STAT3的磷酸化激活，继而阻断JAK/STAT信号转导路径。结核杆菌感染巨噬细胞后，诱导其生成大量的TNF-α，使得Caspases酶活性增强以启动细胞凋亡。而Caspases酶系可以分解Mcl-1导致其上调。阻断剂抑制Mcl-1的表达后，TNF-α的生成受到抑制以拮抗Mcl-1的下调。MAPK通路通过三条支路共同发挥作用，以致于Mcl-1的表达显著下调；而JAK/STAT和PI3K途径阻断后Mcl-1的表达较少。因此，MAPK通路阻断后造成更多的Mcl-1表达，诱导更多的小鼠腹腔巨噬凋亡。

为了证实Mcl-1引入结核感染的有效性，我们观察和分析了BCG感染后小鼠的肺脏、肝脏、脾脏和肾脏的脏器指数和HE染色变化。HE染色的结果发现，阻断剂应用后能够有效改善小鼠肺脏、肝脏和脾脏的病理损伤，特别是在阻断剂PD98059处理后(图3)。除此之外，阻断剂的应用还能够减轻小鼠脏器的病变程度。然而，阻断剂应用后对肾脏的影响较小，主要原因可能是肾脏发生结核所需要的病程时间应当较长，而本实验的研究时间较短，并不能观察到肾脏的明显病理改变。

综上所述，阻断Mcl-1表达的信号通路可以有效促进小鼠巨噬细胞凋亡，减少宿主巨噬细胞内潜伏的结核杆菌的存活，改善小鼠脏器因结核感染造成的病理损伤，减轻病变程度。而MAPK通路为结核感染的小鼠巨噬细胞凋亡调控的主要通路。此研究为结核病潜伏感染和持续感染提供了一个新的方向。然而，对于MAPK信号通路的研究仅仅是初步的，其各个支路如何发挥调控作用将在后续的实验中进行深入探讨。