颈迷走神经刺激对大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌氧化应激和细胞自噬的影响研究

雷玉华 赵劲波 张长江 李元红

早期再灌注治疗是临床上治疗心肌梗死最有效的方法，然而再灌注治疗本身也会引起心肌细胞损伤，这种现象称为心肌缺血再灌注(isechemia and reperfusion,IR)损伤。前期研究证实，急性心肌缺血如果不给予再灌注治疗，缺血区梗死面积可达70%，即使给予再灌注治疗后心肌梗死面积仍有30%，而如果给予有效的方法预防再灌注损伤时，心肌梗死面积仅有5%[1]。可见如何减轻IR损伤，对挽救患者心肌改善预后具有重要意义。近年来随着我国急诊经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)的增多，如何预防和治疗IR损伤应该给与更多的重视。

心肌IR中，氧化应激和过度自噬是心肌损伤的重要机制[2-3]。近年来研究发现自主神经失衡，表现为交感神经过度激活，迷走神经活性相对减弱，是氧化应激过度激活的机制之一，通过颈迷走神经刺激(cervical vagus nerve stimulation,CVNS)可以显著抑制IR中氧化应激水平，减轻心肌IR损伤[4-5]。在再灌注阶段，氧化应激是诱导细胞过度自噬的首要原因。因此我们推测自噬也参与了CVNS对大鼠心肌IR的保护作用。本文试探讨CVNS是否通过抑制心肌细胞过度自噬，减轻心肌IR损伤。

材料与方法

1.实验设计和分组 选用成年雄性SD大鼠(200～250g)，购于武汉大学动物实验中心。将24只大鼠随机分为三组：假手术组(SO组)(n=8):大鼠麻醉后开胸，前降支下穿线但不结扎；缺血再灌注组(I/R组)(n=8)：前降支扎闭30min后，再灌2h；颈迷走神经刺激+缺血再灌注组(VNS+I/R组)(n=8)：前降支扎闭时开始给予颈迷走神经电刺激，至再灌注2h结束。

用2%的戊巴比妥钠(45mg/kg，腹腔注射)麻醉后，将大鼠仰卧固定于鼠板，气管插管，连接小动物呼吸机(70次/min)，记录肢导心电图(BIOPAC，美国)，直至再灌注结束。开胸后，将大鼠前降支与一段带凹槽的中空乳胶管用5-0线一同结扎，结扎后心尖部心肌发白，II导联ST段上抬，提示缺血成功，30min后剪断结扎线，再灌注2h。结扎后心尖部变白和心电图II导联ST段抬高表示缺血成功。

再灌注后，经颈静脉采血2mL，静置后离心，取上清，冻存于-80℃冰箱至检测。迅速剪取心脏，清洗后，留取左心室心尖区(梗死+缺血区)心肌，冻存于-80℃冰箱至检测。

2.颈迷走神经刺激 SO和I/R组中，仅分离右侧经迷走神经干。CVNS+I/R组中，分离右侧经迷走神经干，用自制银电极钩，钩住迷走神经干给予电刺激(10Hz，脉宽：2ms)以心率下降10%为理想电压(本实验电压值1-7v不等)，刺激由缺血前开始至再灌注后结束。

3.心肌损伤标志物检测 检测大鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase，CK)和肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)水平，评价心肌损伤情况。选用南京建成生物工程所试剂盒，检测血清CK和cTnI水平，严格按照操作说明操作。

4.MDA和SOD检测 检测心肌细胞内丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性评价氧化应激水平。选用武汉建成生物工程所试剂盒，检测MDA水平盒SOD活性，严格按着说明操作。

5.Western blot检测 采用WB法检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)和自噬蛋白LC3和beclin-1的表达。方法如前所述[8]，简言之，采用12%PAGE胶，电泳转膜后，选用5%脱脂奶粉封闭，4℃孵育一抗[抗LC3(1∶500稀释，sigma，美国)，抗Bcl-2(1∶500，santa，美国)，抗Beclin-1(1∶500，Abcam，英国)]过夜，用相应的二抗孵育后，ECL显色，以β-actin为内参，计算三种凋亡蛋白的相对表达量。

6.数据分析 采用SPSS17.0软件包分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.CVNS减轻心肌IR损伤 与SO组比较，IR组CK和cTnI的表达显著升高(P<0.05)；与I/R组比较，CVNS+I/R组中，CK和cTnI的表达显著下降(P<0.05，表1)。

2.CVNS抑制氧化应激 与SO组比较，IR组中MDA水平显著增加，SOD活性显著降低(P<0.05)；与IR组比较，CVNS可以显著抑制MDA的表达，增加SOD的活性(P<0.05，表1)。

3. CVNS抑制心肌细胞Bcl-2的表达 与SO组和IR组比较，CVNS+IR组中Bcl-2的表达显著升高(P<0.05，表2)。

4.CVNS抑制心肌细胞过度自噬 与SO组比较，IR组中beclin-1水平和LC3-II/I值显著增加(P<0.05)。与IR组比较，CVNS可以显著抑制beclin-1的表达和LC3-II/I值(P<0.05，表2，图1)。

表1 CVNS对心肌损伤和氧化应激的影响

注：与SO组比较，*P<0.05；与IR组比较，#P<0.05

表2 CVNS对细胞自噬的影响

注：与SO组比较，*P<0.05；与IR组比较，#P<0.05

颈迷走神经刺激是一种有效的心脏自主神经再平衡策略，可以显著抑制IR诱导的过度氧化应激和心肌损伤[4-5]。本研究进一步印证了上述结论，但本研究还发现，CVNS还可以有效抑制IR中心肌细胞过度自噬。

图1 CVNS对自噬蛋白表达的影响

讨 论

一般认为，自噬是细胞的一种自我保护机制，可以吞噬破损的细胞器、降解的蛋白等，对维持细胞稳态具有重要意义。但在心肌IR模型中，研究证实，缺血期细胞自噬具有保护作用，而再灌注阶段大量活性氧的产生可以引起细胞过度自噬，造成心肌损伤[4,6-7]。研究[8-9]证实，在再灌注阶段自噬被过度激活，表现为beclin-1表达的增高和Bcl-2表达降低，bcl-2表达降低可进一步诱导细胞凋亡的发生。Beclin-1是自噬的关键蛋白，它调节自噬小体的形成和发展。再灌注阶段beclin-1表达显著增加，而通过siRNA抑制beclin-1表达可以显著抑制细胞自噬水平和再灌注损伤[10-11]。另外，Brady等[12]研究证实，在饥饿状态下，Bcl-2可以与肌浆网结合，通过抑制钙超载抑制细胞过度自噬的发生。本研究发现，CVNS可以有效抑制Beclin-1的高表达，增加Bcl-2的表达，因此抑制了细胞过度自噬。我们知道，与缺血期相比，再灌注阶段大量活性氧的产生取代了能量耗竭，成为再灌注损伤的首要因素。Hariharan等[13]研究发现，活性氧的产生往往伴随着beclin-1的高表达，而给予还原剂MPG可以有效抑制beclin-1表达，提示活性氧可能是再灌注阶段引起beclin-1高表达和细胞过度自噬的重要因素。另外研究发现，活性氧可以抑制自噬相关4(ATG4)活性、酯化LC3、激活细胞自噬[14]。这些结果均表明，活性氧是诱导细胞过度自噬的重要原因。本研究发现，CVNS可以有效抑制活性氧的产生，抑制心肌细胞过度自噬，因此我们推测在IR模型中，CVNS可能是通过抑制氧化应激抑制心肌细胞过度自噬。

再灌注治疗是治疗急性心肌梗死最有效的方法，而再灌注损伤极大的限制了再灌注治疗的疗效，本研究发现CVNS可以有效抑制IR中心肌细胞氧化应激和自噬水平，从而减轻再灌注心肌损伤。因此研究者认为，在临床上，对于急诊PCI患者可以给与无创颈部迷走神经或耳缘迷走神经刺激，从而有效减轻心肌IR损伤，改善急性心梗患者预后。

综上所述，本研究发现：1CVNS可以有效抑制IR中心肌细胞氧化应激水平和细胞损伤；2CVNS可以显著抑制IR引起的细胞过度自噬，其机制可能与增加Bcl-2表达、抑制氧化应激水平有关。