Wnt/β-catenin信号活化与乳腺癌肿瘤浸润淋巴细胞的相关性及其临床意义

马兴聪，闫婉君，赵小瑶，赵茜茜，赵梓彤，陈银溪，杨 倩，张淑群

(西安交通大学第二附属医院肿瘤病院，陕西西安 710004)

肿瘤与机体免疫系统相互作用产生的抗肿瘤免疫应答是众多免疫分子及细胞群参与的多步骤反应过程，密切影响肿瘤的进展方向。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)是指被募集至肿瘤间质或瘤内的淋巴细胞群，其浸润水平及功能对抗肿瘤免疫效果产生重要影响[1]。大量回顾性临床研究显示，TILs的类型及数量与肿瘤患者预后相关[2]。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)和HER2过表达型乳腺癌中，淋巴细胞瘤内浸润显著增多，并提示较好的生存及疾病结局[3-4]。此外，有报道指出TILs水平影响TNBC及HER2过表达型乳腺癌对新辅助化疗、辅助化疗及曲妥珠单抗治疗的反应性[5-7]。因此，研究乳腺癌中影响淋巴细胞浸润的相关因素并进行干预，可能有助于提高患者的抗肿瘤免疫机能，提高临床肿瘤治疗效果，改善患者预后。

Wnt/β-catenin信号通路是造血系统发育的关键调控因子。Wnt/β-catenin信号对外周淋巴细胞的成熟、分化及功能进行调节，例如，Wnt/β-catenin信号可负性调控效应T细胞功能活化[8]。遗传变异或肿瘤诱导的树突状细胞(dendritic cell, DCs)内β-catenin信号可调控免疫应答与免疫耐受之间的平衡[9]。结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤均可检测到Wnt/β-catenin信号异常激活[10]。恶性黑色素瘤中，SPRANGER等[11]首次报道肿瘤内源性Wnt/β-catenin信号活化抑制淋巴细胞向肿瘤微环境浸润，导致肿瘤对抗PD-L1/抗-CTLA-4单克隆抗体治疗产生抵抗。上述研究结果提示，Wnt/β-catenin信号可能在肿瘤免疫应答过程中发挥重要作用，而其是否参与调控乳腺癌抗肿瘤免疫反应尚不清楚。

本研究通过检测乳腺癌β-catenin的表达及间质浸润淋巴细胞的分布情况，分析两者之间的相关性，探究Wnt/β-catenin信号对乳腺癌免微环境的影响，为乳腺癌的抗肿瘤治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1标本来源收集西安交通大学第二附属医院肿瘤病院2013年6月至2014年12月原发性乳腺癌女性患者90例手术组织蜡块，均经术后病理确诊为浸润性导管癌，术前未行放化疗。患者年龄29～75岁，中位年龄50岁。相关临床病理资料采集自本院病理诊断报告。雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)阳性判断标准为≥1%肿瘤细胞核呈现不同程度着色。HER2阳性判断标准为IHC评分3+或IHC评分2+，荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)结果阳性[12]。

1.2HE染色检测肿瘤浸润淋巴细胞乳腺癌组织标本制作5 μm厚度连续石蜡切片。切片经常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水处理后，以苏木素-伊红染料染色。染色完成后进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后以中性树脂封片。目前多数的研究表明间质TILs较肿瘤内TILs更有预测价值，可重复性强。故本研究关注肿瘤间质TILs。肿瘤间质TILs为癌巢间质组织中散在分布的，与肿瘤细胞没有直接接触的淋巴细胞。依SALGADO等[13]制定的乳腺癌TILs评价标准及指南，间质TILs百分比定义为显微镜视野下，肿瘤边界内单核淋巴细胞所分布的区域占据间质总面积的百分比。视野选择避免有人为挤压、坏死、退行玻璃样变和之前针芯活检部位的TILs。在异质性肿瘤内，评估不同区域的TILs，报告均值。避免将目光聚焦在TILs明显增多的热点区域。所有结果均由有经验的2位病理科医师在不了解患者临床资料的情况下独立判断。以半定量法报告结果，将肿瘤间质TILs百分比分为TILs低、TILs中、TILs高3级，分别对应间质TILs百分比>10%、10%～40%及≥40%。

1.3免疫组织化学染色检测β-catenin表达采用免疫组化SP法检测乳腺癌组织β-catenin表达。5 μm石蜡切片经常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水处理后，置于枸橼酸钠缓冲液(10 mmol/L，pH 6.0)中进行热抗原修复15 min，待冷却至室温。接着采用免疫组化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)完成后续步骤。切片上滴加0.88 mol/L H2O2溶液室温孵育10 min，1×磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗。滴加正常羊血清封闭，室温20 min。将羊血清倾去，每张切片滴加60 μL一抗(兔抗人β-catenin单克隆抗体，ab32572, clone E247, Abcam, 美国；1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜。取出切片后1×PBS漂洗，滴加HRP兔型二抗，37 ℃孵育30 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。1×PBS漂洗后进行DAB显色，接着采用苏木素复染。常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。釆用1×PBS代替一抗作为阴性对照。整张切片由自动玻片扫描仪(Zeiss Axio Scan .Z1, Jena, 德国)拍照。

1.4组化结果评判标准β-catenin表达水平的评价分为阳性细胞比例及细胞胞质/胞核染色强度两方面，采用半定量积分法判定结果。每张切片随机选5个高倍视野观察，阳性细胞数≤5%计为0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，≥75%计4分；根据阳性细胞染色强度，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。综合组织学评分由两类评分相乘，0～1分为阴性(-)，2～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性()，9～12分为强阳性()。在统计分析时，将(-)及(+)判定为β-catenin阴性；()及()判定为β-catenin阳性。评分均由2名病理科医师采用双盲法判定。

1.5统计学分析各分类资料组间比较采用卡方(χ2)检验或Fisher确切概率法。等级资料比较采用Kruskal-Wallis 秩和检验。两指标之间相关性分析采用Pearson相关分析。所有统计分析采用SPSS 20.0软件完成，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1乳腺癌β-catenin表达水平与临床病理特征及肿瘤分子分型的关系90例乳腺癌样本的临床病理信息及肿瘤组织β-catenin表达情况如表1所示。乳腺癌组织β-catenin胞质/胞核异常聚集与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、HER2表达及肿瘤临床分期无显著相关性，而与肿瘤组织学分级以及ER、PR表达状态相关。乳腺癌β-catenin阳性率随组织学分级的增高而有增加趋势。高分化(G1)组β-catenin阳性率为41.9%，中分化(G2)组为65.6%，高分化组(G3)为77.8%，差异有统计学意义(P<0.05)。ER阴性组β-catenin阳性率显著高于ER阳性组(78.0%vs. 46.9%，P<0.01)。PR阴性组β-catenin阳性率也较阳性组升高，差异有统计学意义(76.0%vs. 49.0%，P<0.01)。

2.2β-catenin在不同乳腺癌分子亚型中的表达情况由于乳腺癌分子亚型分类主要依据病理切片ER、PR及HER2表达情况，而上述结果提示β-catenin的表达与乳腺癌患者ER、PR表达状况密切相关，因此，我们进一步将病例分为luminal A型(36.7%)，luminal B型(24.4%)，HER2过表达型(20.0%)及TNBC(18.9%)，分析β-catenin在不同乳腺癌分子亚型中的表达情况。如表2所示， β-catenin在激素受体阴性乳腺癌(HER2过表达型及TNBC)的表达高于激素受体阳性组(luminal A型与luminal B型)，差异有统计学意义(P<0.05)，提示Wnt/β-catenin通路的功能在激素受体阴性乳腺癌HER2过表达型及TNBC中显著异常活化。

表1β-catenin表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系

Tab.1 Correlation between the expression of β-catenin and clinicopathologic parameters in 90 primary breast cancer patients

[n(%)]

表2不同乳腺癌分子亚型中β-catenin的表达

Tab.2 β-catenin expression among molecular subtypes of breast cancer

[n(%)]

* 激素阳性型乳腺癌(Luminal A型与Luminal B型)与激素阴性型(HER2过表达型与三阴性型)乳腺癌比较。

2.3乳腺癌β-catenin异常表达与肿瘤间质浸润淋巴细胞的相关性对连续切片分别进行β-catenin及间质TILs的染色，并选取相同视野对两个指标进行病理学评价，以观察Wnt/β-catenin信号与乳腺癌TILs的相关性。如图1所示，肿瘤间质TILs密度较高的乳腺癌组织，其对应β-catenin表达显著高于TILs较少的肿瘤组织。β-catenin评分随着肿瘤间质TILs密度的升高而增加，差异具有统计学意义(P<0.01，图2A)。进一步通过Pearson相关分析得到间质TILs百分比与β-catenin胞质/胞核阳性细胞百分比之间具有线性相关关系(r=0.732，P<0.001，图2B)。在激素阴性乳腺癌亚型中，间质TILs中、高密度的乳腺癌分别有92.9%与88.9%的患者β-catenin异常表达，而间质TILs低密度的乳腺癌对应仅有41.7%为β-catenin异常表达，组间差异有统计学意义(P<0.05，表3)。在激素受体阳性组，我们也观察到近似趋势(P<0.01，表4)。

图1乳腺癌组织间质TILs密度及对应β-catenin的表达情况

Fig.1 Correlation between TILs and β-catenin in breast cancer

A～C：HE染色(×400)；A：60%肿瘤间质TILs浸润；B：20%肿瘤间质TILs浸润；C：5%肿瘤间质TILs浸润；D～F：A～C对应连续切片中β-catenin免疫组化染色(×400)，组织学评分分别为4分、3分、2分。

图2β-catenin异常表达与肿瘤间质浸润淋巴细胞的相关性

Fig.2 Correlation of β-catenin expression with stromal TILs in 90 breast cancer patients

A：Kruskal-Wallis秩和检验分析肿瘤间质TILs浸润密度与β-catenin评分的相关性；B：Pearson相关分析揭示肿瘤间质TILs浸润密度与β-catenin阳性细胞百分比的线性相关关系。

表3激素受体阴性乳腺癌β-catenin表达与间质TILs分布

Tab.3 Correlation between presence of stromal TILs and β-catenin expression in hormone receptor negative breast cancer

[n(%)]

表4激素受体阳性乳腺癌β-catenin表达与间质TILs分布

Tab.4 Correlation between presence of stromal TILs and β-catenin expression in hormone receptor positive breast cancer

[n(%)]

3 讨 论

Wnt信号通路具有高度进化保守性，其作用涉及多种基本的细胞生物学功能，如胚胎发育过程中的细胞存活或死亡的选择，细胞极性的决定，细胞增殖、凋亡、分化、迁移，干细胞自我更新等，在组织器官发育及内稳态的维持中发挥关键作用。该通路功能异常能够导致个体发育缺陷和疾病。经典Wnt/β-catenin通路信号异常是人恶性肿瘤中最常见的信号异常之一[14]。免疫学相关研究表明，Wnt/β-catenin通路是调控胸腺细胞发育及外周淋巴细胞功能的关键信号，可通过多种途径参与肿瘤免疫的调节[8]。目前Wnt/β-catenin信号活化对抗肿瘤免疫的影响尚存在争议。一方面，肿瘤内源性Wnt/β-catenin信号激活后，可抑制DCs抗原提呈和促炎性细胞因子分泌，促进免疫抑制性细胞因子分泌，并诱导调节性T细胞分化[15-18]，从而抑制肿瘤微环境中淋巴细胞的免疫监视及清除功能。另一方面，Wnt/β-catenin是维持造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)自我更新及干性的关键信号[19]。在小鼠模型中，激活Wnt信号通路可抑制CD8+T细胞向效应细胞分化，并诱导出具有与记忆性干细胞样T细胞(stem cell memory T cells, TSCM)相似表型的CD8+T细胞亚群，而这种细胞与中央记忆性T细胞(central memory T cells, TCM)或效应记忆性T细胞(effector memory T cells, TEM)相比，具有更强的增殖及抗肿瘤功能[20]。这些研究结果提示Wnt/β-catenin通路或能促进成熟CD8+T细胞的干细胞样特性，对提升T细胞免疫治疗效果有潜在应用价值。

尽管乳腺癌并非传统意义上的免疫原性恶性肿瘤，但近年来大量临床研究揭示免疫系统在乳腺癌的进展中发挥重要作用。TILs与原发性乳腺癌预后具有相关性。在HER2过表达型及TNBC中，高水平TILs与患者更好的治疗反应及疾病结局相关[3-7]。本研究发现，β-catenin胞质/胞核过表达与乳腺癌患者ER/PR状态相关。进一步亚型分析揭示激素受体阴性乳腺癌(HER2过表达型及TNBC)中β-catenin过表达显著高于激素受体阳性乳腺癌，与文献报道的TILs分布趋势相近。

Wnt/β-catenin通路与TILs分布相关性的临床研究鲜有报道。在恶性黑色素瘤研究中，SPRANGER等[11]报道肿瘤内源性Wnt/β-catenin信号活化抑制淋巴细胞向肿瘤微环境浸润，导致荷瘤小鼠对PD-L1/抗-CTLA-4单克隆抗体治疗产生抵抗。本研究结果提示，乳腺癌间质TILs密度与Wnt/β-catenin信号异常表达在激素受体阳性及阴性乳腺癌中均呈正相关。这一结果的不一致性可能与不同的肿瘤背景及检测指标、方法的差异相关。由于HE染色仅能获得形态学及数量信息，在研究浸润淋巴细胞功能状态方面受到限制，进一步探究Wnt/β-catenin通路活性与乳腺癌TILs功能特征的相关性及Wnt/β-catenin信号干预肿瘤免疫的分子机制，对揭示肿瘤淋巴细胞浸润的影响因素，寻求提高肿瘤免疫治疗效果的干预途径具有潜在临床价值。