肢体远隔缺血适应对急性ST段抬高型心肌梗死直接经皮冠状动脉介入治疗患者循环血微小核糖核酸-208b水平及术后心功能影响

刘灿章，谢莲娜，郎明非，曾凯东，蒋梦，王丽君，解泽宙，魏显敬，王凯君

肢体远隔缺血适应（RIC）指对肢体实施短暂反复的缺血适应，减轻再灌注对心肌带来的损伤，从而减少心肌梗死面积，改善患者临床远期预后[1，2]。miR-208b是一种小分子microRNA，在组织出现微小损伤时可快速释放入血，并在心肌组织中特异性高表达[3，4]。在急性心肌梗死时升高，可作为早期心肌损伤的标记物[5]。动物实验提出心肌缺血再灌注损伤后miR-208b表达水平升高[6]，在急性心肌梗死患者中缺血适应可以调节microRNA的表达水平[7，8]，但急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者中RIC对微小核糖核酸-208b（miR-208b）表达量变化的影响少见报道。本课题将观察肢体RIC对STEMI直接经皮冠状动脉介入治疗（PCI）患者外周血miR-208b水平的影响。

1 资料与方法

对象及分组：入选2016-01至2017-07在大连大学附属中山医院循环四科连续入院接受PCI术的STEMI患者。STEMI诊断标准：缺血性胸痛持续30 min以上，休息或含服硝酸甘油后症状不能缓解；心电图相邻2个导联ST段抬高大于0.1 mV（V2～3导联ST段抬高大于0.2 mV）；心肌坏死标记物[肌钙蛋白或肌酸激酶同工酶（CK-MB）大于正常范围2倍以上]。入选标准：（1）符合STEMI诊断标准的患者；（2）18岁＜年龄＜80岁；（3）冠状动脉造影示梗死相关血管（IRA）为闭塞性病变，IRA远端无侧支循环；（4）持续性胸痛开始至IRA血流再灌注≤12 h；（5）同意参与本试验人群。排除标准：（1）既往明确的陈旧性心肌梗死；（2）已知严重的外周动脉疾病；（3）恶性肿瘤；（4）合并肾脏疾病并导致严重肾功能不全（血清肌酐 ＞353 μmol/L）；（5） 并发心脏骤停、心原性休克；（6）罪犯血管未成功开通者；（7）术后退出本研究患者。本研究获得大连大学附属中山医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。分组：患者根据不同梗死部位按入院顺序2:1比例分为肢体RIC组50例（前壁20例、非前壁30例）及对照组25例（前壁10例、非前壁15例）。肢体RIC组行直接PCI术联合肢体RIC操作，对照组将袖带绑好后不进行加压操作，仅进行直接PCI术。

直接PCI：患者到达医院急诊科完成12/18导联心电图，明确STEMI诊断后，立即给予双联抗血小板及阿托伐他汀口服，并直接送入导管室，行冠状动脉造影检查，明确梗死相关血管后，即刻行介入治疗开通梗死相关血管。介入治疗术中的具体操作包括是否进行血栓抽吸、球囊及支架大小等由术者决定。成功PCI标准:残余狭窄≤30%，心肌梗死溶栓治疗临床试验（TIMI）2～3级血流且无急性并发症。术后应用药物依据患者病情及相关指南推荐应用。

肢体RIC操作方法：肢体RIC组进入导管室躺在手术床上后与直接PCI术同时开始，即刻于右下肢距膝关节上方3～5 cm处绑缚无创血压袖带，立即开始时充气加压至 200 mmHg（ 1 mmHg =0.133 kPa）以阻断下肢血流，以足背动脉搏动消失为准。充气5 min，放气5 min，循环至血管开通。如血管开通时未完成3次循环，则继续完成3次循环。以上操作与PCI术同时进行。

心肌梗死面积：术前、术后 6 h、12 h、18 h、24 h、48 h、72 h采静脉血2 ml，送大连大学附属中山医院检验科采用西门子advia1200全自动生化分析仪运用化学发光法测定血浆CK-MB水平。应用 Origin Pro 8 软件绘制心肌酶-时间曲线并计算曲线下面积（AUC），评估心肌梗死面积[5]。

住院期间心功能：于PCI术后3天内心脏超声科对所有患者进行超声检查，应用改良Simpson's法测左心室射血分数（LVEF）。

血清miR-208b检测：（1）血标本采集及保管：术前、术后即刻、术后24 h、术后48 h各4 ml血液标本，用Z Serum Clot Activator 血清分离胶管收集，采集后即刻离心，离心机设置为3500转，10 min。离心后取上层血清移至200 μl EP管中做好标记 -80℃保存，用以miR-208b的批量检测。（2）血清总RNA的提取：取250 μl血清并与750 μl 总RNA提取试剂（Trizol LS，美国）充分混匀，室温孵育10 min，加入 5 nmol线虫 microRNA（cel-miR-39-3p）5 μl作为外参，再用氯仿抽提，血清总RNA位于所生成的最上层上清液中 ，最后经异丙醇沉淀、离心后，将所得的总RNA溶于20 μl焦碳酸二乙酯处理（DEPC）水中，立即使用或存放于-80℃。（3）血清总RNA的反转录：采用PrimeScript RT试剂盒（宝生物，大连）在聚合酶链反应（PCR）仪（北京东胜创新，北京）上进行反转录，反应条件：42℃，15 min；85℃，5 s，cel-miR-39-3p及hsa-miR-208b-3p的反转录引物购自广州锐博生物科技有限公司，反转录反应生成的cDNA于-20℃保存备用。（4）血清miR-208b的相对表达量的检测：用CFX-Connect实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国），按照SYBR®Premix Ex TaqTMII qPCR试剂盒（宝生物）方法检测miR-280b的表达。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。所有RT-qPCR引物购自广州锐博。用2-ΔΔCt方法计算血清miR-208b的相对表达量，使用均数±标准差（）表示。

统计学方法：数据采用IBM SPSS.19.0软件进行相关数据统计分析。数据都应检验是否符合正态性分布及方差齐性检验分析。其中计量资料均采用来表示，组间比较通过独立样本t检验，组内4个时间点比较通过单因素方差析验；计数资料采用率的百分比来表示，结果以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

一般资料：两组患者基线临床资料比较差异无统计学意义（表1）。

两组患者CK-MB比较及住院期间心功能评估（表2，图1）: 住院期间肢体RIC组CK-MB AUC及CK-MB Peak均低于对照组（P＜0.05），LVEF高于对照组（P＜0.01），差异均有统计学意义。肢体RIC组NT-proBNP较对照组有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 两组患者CK-MB比较及住院期间心功能评估[例(%)]

图1 CK-MB释放平均浓度曲线下面积比较

两组患者血清miR-208b表达量比较（表3）:对照组直接PCI术后即刻较术前升高（P=0.032），术后24 h明显下降（与术前比较P=0.015，与术后即刻比较P=0.018），术后48小时进一步下降（与术前比较P=0.017，与术后即刻比较P=0.013，与术后24 h比较P=0.526）。肢体RIC组术后即刻较术前降低（P=0.028），术后24 h明显下降（与术前比较P=0.014，与术后即刻比较P=0.015），术后48 h进一步下降（与术前比较P=0.017，与术后即刻比较P=0.015，与术后24 h比较P=0.678）。

两组患者之间循环miR-208b表达量比较（表3）：术后即刻肢体RIC组低于对照组（P=0.021），差异有统计学意义；术前（P=0.874）、术后24 h（P=0.637）及术后48 h（P=0.874），两组间差异无统计学意义。

表3 两组miR-208b表达量比较（）

表3 两组miR-208b表达量比较（）

注：RIC：远隔缺血适应。与术前比较*P＜0.05； 与术后即刻比较ΔP＜0.05；与对照组比较▲P＜0.05

组别 术前 术后即刻 术后24 h 术后48 h对照组 77.8±9.4 84.1±9.0* 29.9±12.1*Δ 16.8±8.6*Δ肢体 RIC 组 77.4±8.8 71.0±9.3*▲ 28.6±19.2*Δ 17.1±11.3*Δ

肢体RIC组术后血清miR-208b与CK-MB AUC相关性分析（图2）:Pearson相关性分析显示，肢体RIC组患者术后血清miR-208b的表达水平与CK-MB AUC 呈明显正相关（r=0.498，P＜0.001）。

图2 肢体RIC组术后血清miR-208b与CK-MB AUC相关性分析

3 讨论

肢体RIC通过对远隔靶器官的远端组织实施短暂反复的缺血适应，从而对靶器官的再灌注损伤产生保护作用。由于其操作简便、安全无创等优点，避免了对罪犯血管的过度干预。Murry等[9]在动物实验中发现RIC可以降低心肌再灌注40 min时的心肌梗死面积，国内外临床研究表明RIC可以减少急性心肌梗死患者心肌梗死面积及临床远期预后[10，11]，本研究同样得出肢体RIC组酶学心肌梗死面积及平均浓度酶峰低于对照组，进一步证实肢体RIC具有保护心肌的作用。

miR-208b是一种心肌特异性表达因子，分子量小在组织出现微小损伤时可快速释放入血，国内外研究提出急性心肌梗死时表达量升高，显示其在急性心肌梗死患者血浆中增加了1 600倍，健康人则无表达[3，4，12]。本研究通过对患者术前血液标本的检测发现，miR-208b有较高的表达水平，这与既往研究结果一致，在心肌损伤早期释放入血，可作为诊断心肌损伤的标记物。在Bian及Andersson动物实验提出心肌缺血再灌注损伤后miR-208b表达水平较再灌注前升高[13]，国内研究发现STEMI患者再灌注后miR-19a/b表达量变化[14]，但关于miR-208b的临床实验尚少见报道，本试验通过对照组术前、术后的血液分析，发现急性STEMI患者再灌注后miR-208b表达水平较再灌注前升高，这与动物实验结果相符。提示心肌再灌注后带来的额外心肌细胞损伤，使miR-208b快速释放入血。Cortezdias等[7]及Zhu等[8]发现RIC可以调节急性心肌梗死患者中microRNA的表达水平，在离体小鼠模型中发现RIC同样可调剂多种microRNA的表达，但在动物实验及临床实验中RIC对miR-208b的调节少见报道[15-18]，本试验通过急性STMEI患者肢体RIC操作，得出肢体RIC组患者术后较术前表达量降低，可以调剂miR-208b的表达量。两组术前术后表达量变化分析，术前表达量相似，对比术后发现对照组患者表达量升高，肢体RIC组表达量降低，并且低于术前水平。

国内外多项研究证实分别对100例、696例、258例STEMI患者实施短暂的肢体RIC可以减少心肌梗死面积[19-22]。本研究结果提示肢体RIC组患者梗死面积减小，并且峰值降低，这与既往研究相符，提示肢体RIC可以保护心肌细胞。但国内相关实验对46例STEMI患者行肢体RIC，提出酶学梗死面积无明显减少[23]。考虑与纳入实验患者数量少，并未采用影像学评估梗死面积低估了肢体RIC的保护作用的局限性有关。国内研究[22]发现肢体RIC可以提高术后LVEF，改善心功能。本研究通过术后心脏超声评估提出相同结论，肢体RIC组术后LVEF提高，NT-proBNP有降低趋势。通过对肢体RIC术后血清miR-208b与CK-MB AUC 相关性分析发现其存在明显的正相关。肢体RIC组酶学梗死面积减少，术后即刻血清miR-208b表达量降低，提示我们miR-208b不仅能作为心肌损伤的标记物，并可通过其表达量来推断心肌梗死面积的大小。

不足之处：本研究是单中心小型临床试验，而且仅观察了肢体RIC对成功直接PCI的STEMI患者血清miR-208b水平的影响，有关肢体RIC所致血清miR-208b水平变化的临床意义尚需更大规模的临床研究进一步探讨。

本研究提示肢体RIC降低STEMI直接PCI术患者循环血miR-208b水平，并可以改善患者心功能。