西柏三烯-4,6-二醇降解菌的筛选鉴定及其在再造烟叶中的应用

黄 申，霍梦杰，钱玉梅，魏 涛，贾春晓，何春雨，杨 峰，樊新顺，毛多斌*

(1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450003; 2.河南卷烟工业烟草薄片有限公司，河南 许昌 461000)

西柏烯类化合物是烟草中一类重要的香味前体物质，主要存在于烟叶表面腺毛分泌物中[1]，目前已发现的该类化合物有52种[2]，其中西柏三烯-4,6-二醇(CBT)含量较高，占烟叶表面总类脂物的50%[3]。在烟草陈化和调制过程中西柏烯类物质发生降解[4-5]，产生的香味化合物数量超过60种，茄酮、茄呢呋喃、降茄二酮等烟草香味成分都是西柏烯降解产物[6-7]。由此可见，该类化合物的降解转化对烟草香味的产生具有十分重要的作用。充分利用该类化合物的降解产香作用，对于改善再造烟叶品质及使用价值、增加其香气和安全性具有重要价值。

再造烟叶是以烟末、烟叶碎片和低次烟叶等为原材料，通过不同的加工工艺制成的再生产品[8-9]，有利于降焦减害，已作为卷烟填充料被应用于卷烟产品中[10]。但再造烟叶存在香气量不足、杂气重和口感差等吸味缺陷，影响了其在卷烟产品中的使用效果和添加量。国内通常的做法是采用添加剂进行改善，目前应用较多的添加剂是烟草以及天然植物提取物，这些提取物一般通过水、醇提取或分子蒸馏得到，添加后对卷烟质量的改善程度有限，且存在一定的安全隐患。因此，如何安全有效地提高再造烟叶的内在品质已成为烟草行业关注的焦点。目前，通过生物产香的方法提高再造烟叶的香气量和香气质越来越受到行业内的重视。基于此，以CBT为唯一碳源，筛选得到1株高效降解CBT产香的菌株，并将其应用到再造烟叶浓缩液中，以提高再造烟叶的香气量和香气质。

1 材料和方法

1.1 样品与培养基

1.1.1 烟叶样品 在国家烟草专卖局河南省三门峡烟叶种植基地采集不同品种的初烤后片烟样品：7478、AC102、中烟206、AC89、秦烟96、QY201、CC27、贵烟6号、Y077、Y056、金神农1号、中烟100、AC55、AC194、7529、Y106、Y074、PVH1452、云烟27、AC71。

1.1.2 试剂及仪器 CBT自制，纯度≥98%；主要仪器：Agilent 6890a/5975c GC-MS色谱联用仪(Agilent公司)、J6-MI冷冻离心机(美国Beckman公司)、摇床(上海福玛实验设备有限公司，QYC-211)、生化培养箱(上海福玛实验设备有限公司，DPX-9052B-2)、超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技有限公司，JY92-IIDN)、电子天平(赛多利科学仪器有限公司，BSA323S)、分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，MS205DU)。

1.1.3 培养基 LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。发酵培养基1：KNO31.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、CBT 0.3 g/L。固体发酵培养基：在发酵培养基1的基础上加入2 g/L琼脂粉。发酵培养基2：在发酵培养基1的基础上加入麦芽糖2 g/L。

1.2 方法

1.2.1 CBT降解菌的筛选[11]称取不同品种的初烤后片烟叶样品5 g，剪碎后放入盛有100 mL无菌水的三角瓶中，浸泡过夜，移取1 mL至100 mL LB培养基内，30 ℃、150 r/min条件下培养24 h，得到菌源。取1 mL菌源到100 mL发酵培养基1中，培养4～6 d，根据GC-MS检测结果，挑选CBT降解菌，再从中移取1 mL进行梯度稀释，以不同浓度梯度在固体发酵培养基上进行平板涂布。将涂布好的平板放于30 ℃培养箱培养2～4 d，挑选出形态较好、有透明圈产生的单菌落，反复划线进行分离纯化，直到平板上无杂菌落出现。将纯化出的单菌落接种于100 mL发酵培养基1中，30 ℃、150 r/min培养2～4 d，采用GC-MS分析检测发酵液，最终筛选具有降解CBT能力的菌株。

1.2.2 CBT降解产物的分析检测[12]

1.2.2.1 CBT标准曲线的制备 用万分之一电子分析天平准确称取CBT 11.09 mg，用色谱级二氯甲烷溶解，并定容到100 mL容量瓶中，得到一定浓度的标准储备液。分别准确移取混合标准储备液 0.1、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL，用色谱级二氯甲烷分别定容至10 mL容量瓶中，摇匀，即得到含有不同质量浓度梯度的CBT标准溶液。根据所得数据制定标准曲线的线性方程为y=2.464 17×106x-5.056 8×107(R2=0.999 62)。

1.2.2.2 CBT降解产物的萃取 量取培养完成后的CBT降解菌发酵液30 mL，10 000 r/min离心20 min，取上清液与等体积的二氯甲烷在分液漏斗中进行萃取，缓缓摇晃，使两相混合均匀，静置10 min后，收集下层有机相，重复以上步骤3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，静置过夜，过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷后，加入1 mL色谱纯二氯甲烷溶解，过0.45 μm有机系滤膜后，用GC-MS分析检测。

1.2.2.3 检测条件 色谱条件：HP-5 MS 5% Phenyl Methyl Silox(型号为30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度280 ℃；高纯氦气作载气，流速为1 mL/min；程序升温：初始温度为50 ℃，保持4 min，然后以2 ℃/min的升温速度升至240 ℃结束；不分流；进样量为1 μL；GC-MS采用全扫模式。质谱条件：传输线温度280 ℃；离子源温度为280 ℃，四极杆温度150 ℃；电离方式为电子轰击(EI)，电子能量为70 eV；溶剂延迟时间为8 min；扫描质量范围：35～550 m/z 。

1.2.2.4 CBT降解率的测定与计算 根据GC-MS测定结果计算CBT的降解率。计算公式为：

CBT降解率=CBT减少量/原有CBT含量×100%。

1.2.3 CBT降解菌的鉴定[13]

1.2.3.1 CBT降解菌形态特征鉴定 将所筛选的CBT降解菌接种于固体培养基上，培养72 h后在油镜下观察菌落和菌种形态，进行形态特征鉴定。

1.2.3.2 16S rRNA序列扩增、测序及系统发育分析 用细菌基因组抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，PCR反应引物为16S rDNA序列通用引物5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系：Taq酶 (5 U/μL) 0.2 μL、上下游引物 (10 μmol/L)各0.5 μL、10×Buffer (10 μmol/L) 2.5 μL、DNA模板(50 ng/μL) 0.5 μL、dNTP(10 μmol/L) 1 μL、dH2O 19.8 μL。DNA序列在生工生物工程(上海)股份有限公司测定。系统发育分析采用MEGA 5.1软件构建系统进化树，使用Neighbor-Joining 法进行1 000 次步长计算。

1.2.3.3 CBT降解曲线的测定 将筛选的CBT降解菌单菌落接入LB培养基，30 ℃、150 r/min培养24 h，然后按1%的浓度接种到发酵培养基1中，分别测定培养6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、80、88 h发酵液的CBT降解率，并测定不同时段发酵液的OD600。

1.2.4 CBT降解菌在再造烟叶中的应用

1.2.4.1 菌制剂及酶制剂的制备 将筛选的CBT降解菌单菌落接入LB培养基，30 ℃、150 r/min培养24 h，制得种子液，然后按1%的浓度接种到LB培养基，30 ℃、150 r/min培养24 h，发酵液即为菌制剂。菌制剂于10 000 r/min下离心10 min得到菌体，利用PBS(用量为菌体湿质量的10～15倍)重悬后超声破碎(超声条件：功率60%、超声时间30 min、工作2 s停4 s)，离心除去上清液得到细胞碎片，PBS(用量为LB培养基的10%)重悬后即为酶制剂。

1.2.4.2 菌制剂及酶制剂的应用 取30 mL再造烟叶浓缩液加入到100 mL三角瓶中，接种5%的菌制剂，在30 ℃、150 r/min条件下培养24 h；取30 mL再造烟叶浓缩液加入到100 mL三角瓶中，添加5‰的酶制剂在30 ℃、150 r/min条件下转化24 h。分别将菌制剂和酶制剂处理后的再造烟叶浓缩液加入到分液漏斗中，并加入等体积的二氯甲烷进行分液萃取，重复此步骤3次，合并有机相。加入无水硫酸钠静置过夜，旋转蒸发除去二氯甲烷后，加入1 mL色谱纯二氯甲烷溶解，过0.45 μm有机系滤膜后，采用GC-MS分析检测发酵(转化)前后再造烟叶浓缩液中的香味物质，检测条件同1.2.2.3。

1.2.4.3 菌制剂和酶制剂处理对再造烟叶评吸效果的影响 分别将菌制剂发酵和酶制剂转化的再造烟叶浓缩液涂布到基片后制丝，添加到样品烟支中，以未经发酵和转化的再造烟叶浓缩液涂布制丝的样品烟支为对照(CK)，由15人组成的评烟组对其进行品鉴。

2 结果与分析

2.1 CBT降解菌的分离、筛选与鉴定

2.1.1 菌株的分离与筛选 从初烤后烟叶中筛选到1株降解CBT的菌株H3-1，接种到发酵培养基1中进行发酵培养，采用GC-MS法测定其对CBT的降解能力。结果(图1)显示，菌株H3-1具有降解CBT的能力。

①为发酵前峰图；②为发酵后峰图

2.1.2 菌株H3-1的形态鉴定 将菌株H3-1接种于固体培养基上，培养72 h后，在100倍油镜下观察其形态特征，如图2所示，菌体大小为0.6～0.8 μm×1.5～2.0 μm，呈细杆状，无鞭毛，在固体发酵培养基平板上为黄色圆斑状。

图2 菌株H3-1菌落及细胞形态

2.1.3 菌株H3-1的16S rDNA 序列分析和系统进化树构建 利用细菌16S rDNA特征性引物对菌株H3-1基因组进行PCR扩增，得到1 497 bp目的序列。通过在NCBI GenBank数据库中进行blast同源性分析，发现菌株H3-1与新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumsp)的同源性在99%以上。系统进化树结果(图3)表明，菌株H3-1与新鞘氨醇杆菌聚为一类。基于形态学特征和系统发育分析，初步鉴定菌株H3-1为新鞘氨醇杆菌。

图3 菌株H3-1基于16S rDNA基因序列的系统发育树

2.1.4 CBT降解曲线 从图4可以看出，培养20 h后，新鞘氨醇杆菌H3-1快速增长，进入对数期；随着培养时间继续延长，该菌从培养基中吸收营养物质不断进行繁殖，菌株数量不断增加，至培养50 h开始进入稳定期；CBT的降解曲线与菌株的生长曲线大致呈负相关，在菌体快速生长期，CBT的降解最快。整体看，发酵0～30 h内CBT含量急剧下降，发酵30 h时CBT的降解率达到 85.85%，30 h后趋于平衡。

图4 菌株H3-1的生长曲线与CBT的降解曲线

2.2 不同碳源对新鞘氨醇杆菌H3-1降解CBT产物的影响

采用GC-MS法检测新鞘氨醇杆菌H3-1对CBT的降解产物并结合化合物保留指数法(RI)分析挥发性香气物质及降解产物含量。当发酵培养基仅以CBT为唯一碳源时，CBT的降解产物为金合欢醛；在发酵培养基中再加入2 g/L麦芽糖时，在发酵液中检测到茄酮。不同碳源造成新鞘氨醇杆菌H3-1对CBT的降解产物不同，推测可能是碳源发生了变化，导致菌体某些基因的转录表达发生了变化。

2.3 新鞘氨醇杆菌H3-1在再造烟叶中的应用

2.3.1 添加菌制剂的再造烟叶浓缩液中挥发性物质的变化 采用GC-MS法对菌制剂发酵前后的再造烟叶浓缩液进行挥发性物质检测，发现约有20种成分的含量在发酵后得到明显提升，其中有13种成分的结构可以确定，分别为苯甲醇、2-乙酰基吡咯、甲基麦芽酚、苯乙醇、2-乙基-3-甲基马来酰亚胺、甲基环戊酮、茄酮、二氢猕猴桃内酯、4-羟基-β-二氢大马酮、9-羟基-4,7-巨豆三烯酮、4-(3-羟基丁基)-3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-酮、叶绿醇以及棕榈酸，上述成分较发酵前都有不同程度的提高(表1)，其中，含量超过5%的分别是9-羟基-4,7-巨豆三烯酮、叶绿醇和棕榈酸，较发酵前分别提高2.44倍、3.07倍和1.50倍；甲基麦芽酚、苯乙醇、2-乙基-3-甲基马来酰亚胺、甲基环戊酮和二氢猕猴桃内酯在发酵前未检测到，但发酵后出现；值得注意的是，茄酮含量比发酵前提高了52.2%。

表1 H3-1菌制剂发酵前后再造烟叶浓缩液中挥发性物质含量的变化

注：—代表未检出。

2.3.2 添加酶制剂的再造烟叶浓缩液中挥发性物质的变化 采用GC-MS法对酶制剂转化前后的再造烟叶浓缩液进行挥发性物质检测，发现约有10种成分的含量在转化后得到明显提升，其中有4种成分的结构可以确定(表2)，分别为苯甲醇、2-乙酰基吡咯、苯乙醇、2,3-二氢苯并呋喃，上述4种香味物质较转化前有明显提高，其中，苯甲醇、2,3-二氢苯并呋喃含量分别提高3.61、1.10倍。

2.3.3 菌制剂和酶制剂处理对再造烟叶评吸效果的影响 从表3可以看出，菌制剂发酵的再造烟叶样品和酶制剂转化处理的再造烟叶样品评分较CK都有所提高，分别较CK提高了0.8、0.6分。

表2 H3-1酶制剂转化前后再造烟叶浓缩液中挥发性物质含量的变化

相比CK，菌制剂发酵后的样品有13种香气成分得到不同程度的提高，突显在评吸质量中是香气质、香气量、浓度和杂气项得分都有不同程度的提高，其中以浓度提高最为明显，为0.3分；与CK相比，酶制剂处理后的样品在香气质、香气量和杂气项的得分都有提高，但与菌制剂处理后样品相比，酶制剂转化后的样品浓度得分没有得到提高，但杂气得分提高了0.1分，推测原因可能是酶制剂在制备过程中去除了细胞质组分(细胞质中蛋白质成分含量较高)，提高了杂气项得分。

表3 H3-1菌制剂和酶制剂对再造烟叶评吸效果的影响

3 结论与讨论

CBT是烟草中重要的致香前体物，其氧化降解可产生茄酮、降茄二酮、茄尼呋喃等多种重要中性香味成分，上述成分可与烟香协调，醇和烟气，增加烟草本香。但CBT的生物降解机制尚不明确，已有研究表明，新鞘氨醇杆菌YII-3可将CBT转化为金合欢醛，经过优化，该菌发酵48 h对CBT的降解率为84.71%[14-15]。相比新鞘氨醇杆菌YII-3，本试验筛选出新鞘氨醇杆菌H3-1在发酵培养基1中发酵30 h时CBT降解率可达85.85%，当在培养基中添加麦芽糖时，发酵液中检出茄酮。

由于原料来源多为烟末、烟叶碎片和低次烟叶，制得的再造烟叶虽然有利于降焦减害，但香气量不足、杂气重的缺陷却阻碍了再造烟叶在行业内的应用[8-9]。为抑制再造烟叶中的杂气、增加香气量、改善香气质，以往的研究多采用加入人工香料、烟叶提取物、天然植物提取液以及天然植物提取物的发酵液等方法[16-19]，但效果不显著，而且再造烟叶中外源香料的添加为后期卷烟产品的维护也带来不便。

本试验将新鞘氨醇杆菌H3-1菌制剂添加到再造烟叶浓缩液中发酵后，浓缩液中苯甲醇、2-乙酰基吡咯、甲基麦芽酚、苯乙醇、2-乙基-3-甲基马来酰亚胺、甲基环戊酮、茄酮、二氢猕猴桃内酯、4-羟基-β-二氢大马酮、9-羟基-4,7-巨豆三烯酮、4-(3-羟基丁基)-3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-酮、叶绿醇以及棕榈酸的含量提高；与以往研究相比，增加的香味物质为烟草本香，不会对后期卷烟配方的维护带来困难，而且烟草本香的增加可使再造烟叶应用到高档卷烟中。同时，评吸结果显示，香气质、香气量以及浓度都有不同程度的提升。

将新鞘氨醇杆菌H3-1酶制剂添加到再造烟叶浓缩液中转化后，浓缩液中苯甲醇、2-乙酰基吡咯、苯乙醇以及2,3-二氢苯并呋喃的含量提高。评吸结果显示，香气质和香气量都提高了0.2分。由于酶制剂在制作过程中只保存了结合在细胞壁上的酶，细胞质中大量的酶被丢弃，表现为评吸过程中浓度提升效果不及菌制剂处理样品；与此同时，杂气项得分较菌制剂处理样品增加了0.1分，分析原因，可能是菌制剂处理样品引入了较多的蛋白质而引起的杂气项得分较酶制剂处理样品降低。