炎性因子对星形胶质细胞的活化及sPLA2-ⅡA表达的机制及影响

李雪粉，陈文武，李青，郭安臣，王拥军，王群

随着人们对神经系统疾病研究的深入发现，在神经系统疾病（如脑梗死、脑出血等）的病理过程中，神经炎症的级联反应是很重要的环节[1]。在神经炎症级联反应中，星形胶质细胞（astrocyte，AST）活化并发挥重要作用[2-3]。众所周知，适当的炎症有神经保护作用，但炎症级联过度反而会加重脑组织的损伤。本实验通过在体外培养大鼠AST，在培养基中加入炎性因子白介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α），构建AST的炎症模型，并进一步探究其内在的炎症通路，为神经系统疾病的炎症发病机制提供实验依据。

1 研究对象与方法

1.1 材料 新生Sprague-Dawley（SD）大鼠（出生24 h内，雌雄不分，北京维通利华），细胞黏附剂C1010（北京普利莱），DMEM/F12培养基（美国Gibco），胎牛血清（美国Gibco），双抗（青霉素、链霉素）（美国Gibco），L-谷氨酰胺（美国Sigma），0.25%胰酶（美国Gibco），4%多聚甲醛（北京索莱宝），聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）（美国Sigma），山羊血清（北京中杉金桥），鼠多克隆抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（北京冠星宇），Alexa-Fluor 488标记的羊抗鼠荧光二抗（美国Gibco），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液（美国Sigma），大鼠IL-1β（美国P E P R O T E C H），大鼠T N F-α（美国PEPROTECH），Trizol试剂（美国Ambion），异丙醇（上海国药化学），三氯甲烷（北京化工厂），核-浆蛋白分离试剂盒（北京普利莱），蛋白酶抑制剂（北京普利莱），蛋白磷酸酶抑制剂（北京普利莱），BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱），细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）（日本同仁化学研究所），反转录试剂盒（日本Takara），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（日本Takara），PCR引物（上海英潍捷基），分泌型磷脂酶A2-ⅡA（secretory phospholipase A2 of groupⅡA，sPLA2-ⅡA）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海纪宁）。

1.2 方法

1.2.1 AST的原代培养 将培养瓶用细胞黏附剂C1010包被后放在37 ℃ 5%二氧化碳培养箱中过夜。将SD大鼠消毒后去除颅骨、脑干及小脑，夹出两侧大脑半球至培养皿中。去除脑膜、血管，剥离出大脑皮质组织，将组织移入另一含培养基的培养皿中，将组织剪碎后移入离心管，加2倍体积的0.25%胰酶，消化37 ℃15 min后加培养基终止消化。过滤并吸取滤过的液体放入新的离心管中，1000 rpm 5 min后留沉淀，加完全培养基混匀，以细胞密度3×105/ml接种放在二氧化碳培养箱中进行培养，每天在倒置显微镜下观察细胞的形态，9～12 d后进行细胞传代培养。

传代培养：将培养瓶用细胞黏附剂C1010包被后放在37 ℃ 5%二氧化碳培养箱中过夜。0.25%胰酶消化2 min后加培养基终止消化。将细胞移入离心管中，1000 rpm 5 min。留沉淀以细胞密度3×105/ml进行接种。将培养瓶放在二氧化碳培养箱中进行培养，每天观察细胞的形态以及生长情况等，4～5 d进行传代，传至第3代时进行AST的纯度鉴定。

1.2.2 细胞纯度的鉴定 预先用细胞黏附剂C1010包被4孔板，按照上述细胞传代培养的方法，将第3代AST用0.25%胰酶消化后接种入4孔板，每孔细胞密度3×104/0.5 ml，即为第4代细胞。通过免疫荧光的方法对AST的纯度进行鉴定。

磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤3次，4%多聚甲醛固定30 min。0.2%TritonX-100静置30 min。10%山羊血清封闭1 h后加一抗（一抗为鼠多克隆抗GFAP）室温过夜。二抗（Alexa-Fluor 488标记的羊抗鼠荧光二抗），室温避光放置1 h。DAPI复染5 min后，换为PBS。封片后在荧光显微镜下随机取视野观察，并采集图片。

1.2.3 实验分组

1.2.3.1 不同浓度炎性因子的干预 将第4代A S T接种入24孔板，每孔细胞密度3×104/0.5 ml。随机分为对照组和实验组，实验组分别为：10 ng/ml IL-1β组，100 ng/ml IL-1β组，10 ng/ml TNF-α组，100 ng/ml TNF-α组，10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组，100 ng/ml IL-1β+100 ng/ml TNF-α组。换为去血清培养基，1 h后对照组不做处理，实验组处理如下：10 ng/ml IL-1β组每孔加1 μg/ml IL-1β 5 μl，100 ng/ml IL-1β组每孔加10 μg/ml IL-1β 5 μl，10 ng/ml TNF-α组每孔加1 μg/ml TNF-α 5 μl，100 ng/ml TNF-α组每孔加10 μg/ml TNF-α 5 μl，10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组每孔分别加1 μg/ml IL-1β 5 μl和1 μg/ml TNF-α 5 μl，100 ng/ml IL-1β+100 ng/ml TNF-α组每孔分别加10 μg/ml IL-1β 5 μl和10 μg/ml TNF-α 5 μl。培养20～24 h期间进行细胞活力检测。

1.2.3.2 选取10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组继续干预 将AST接种入6孔板，每孔细胞密度1×106/2 ml，随机分为对照组和实验组。换为去血清培养基，1 h后对照组不做处理，实验组每孔分别加1 μg/ml IL-1β 20 μl和1 μg/ml TNF-α 20 μl。24 h后收集两组培养液及细胞，进行各项指标的测定。

1.2.4 CCK-8检测细胞活性，筛选有效炎性因子的浓度 按照1.2.3.1在24孔板中将细胞分为七组，其中20 h时每孔分别加CCK-8溶液50 μl。24 h时每孔分别抽取300 μl培养基至96孔板中。在酶标仪450 nm处检测各孔的吸光度（optical density，OD）值。

1.2.5 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）

1.2.5.1 总RNA的提取 按照1.2.3.2培养细胞，24 h后PBS洗涤2次，加Trizol试剂，移入EP管室温5 min。向EP管中加200 μl氯仿，冰上放置5 min。12000 rpm 4 ℃离心15 min，分相为3层。吸取上层至新的EP管中，加等体积的异丙醇，放在-20 ℃冰箱30 min冷却。12000 rpm 4 ℃离心10 min，去上清，可见EP管附着白色沉淀，即为RNA。向EP管中加700 μl含焦碳酸二乙酯的75%酒精，轻轻弹起白色沉淀。7000 rpm 4 ℃离心10 min。倒掉75%酒精，向EP管中加20 μl无RNA酶的水（RNase-free water），涡旋溶解沉淀，混匀后即可进行RNA浓度检测。

1.2.5.2 反转录反应 首先去除基因组的DNA ，采用10 μl的反应体系：5×gDNA Eraser Buffer 2 μl；gDNA Eraser 1 μl；Total RNA 1 μg；添加RNase-free water至10 μl。反应条件：42 ℃ 5 min，4 ℃放置。

反转录反应采用20 μ l的反应体系：含去除基因组的DNA中的反应液10 μl，5×PrimeScript Buffer 4 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl，RT Primer Mix 1 μl，RNase-free water 4 μl。反应条件：37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，4 ℃放置。

1.2.5.3 实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR） 20 μl的PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μl；Forward Primer 0.8 μl；Reverse Primer 0.8 μl；cDNA 2 μl；RNase-free water 6.4 μl。扩增反应时间为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。溶解反应时间为：95 ℃ 15 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸15 s。2-△△Ct方法计算目的基因表达量（表1）。

1.2.6 sPLA2-ⅡA酶联免疫分析 按照1.2.3.2培养细胞，24 h收集上清液进行实验。标准孔分别加不同浓度的标准品50 μl。先向待测孔加入10 μl的待测品，再向待测品孔加入40 μl的待测品稀释液（空白孔不加）。用封板膜将微孔完全封闭后在37 ℃恒温箱内放置30 min。揭掉封板膜，每孔加100 μl的酶标试剂（空白孔不加），温育30 min。揭开封板膜，倒掉液体，向各孔加满洗涤液，1 min后弃洗涤液，拍干。重复洗涤5次。向各孔中加50 μl的显色剂A，再向各孔中加50 μl的显色剂B，37 ℃恒温箱内避光放置15 min。向各孔中加50 μl的终止液。15 min内在酶标仪的450 nm处测定各孔的OD值（用空白孔调零）。

1.3 统计学处理 实验均重复3次。采用SPSS 17.0进行统计分析，数据以（）表示，两组比较采用两组独立样本的t检验，两组以上比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AST的纯度 通过AST特异性的标志物GFAP染色进行鉴定。经免疫荧光染色后随机选取的视野内，细胞核经DAPI染色后均为蓝色（43个），AST中的GFAP染色后为绿色（43个）。由此，培养的细胞中AST比例达95%以上（图1）。

2.2 不同浓度炎性因子对AST活性的影响 10 ng/ml IL-1β组、100 ng/ml IL-1β组、10 ng/ml TNF-α组、100 ng/ml TNF-α组、10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组、100 ng/ml IL-1β+100 ng/ml TNF-α组对AST作用24 h后OD值分别为（2.35±0.03）、（2.38±0.05）、（2.35±0.06）、（2.44±0.02）、（2.84±0.16）、（2.70±0.06），均高于对照组（2.31±0.03），但其中只有100 ng/ml IL-1β组、100 ng/ml TNF-α组、10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组和100 ng/ml IL-1β+100 ng/ml TNF-α组与对照组比较，差异有统计学意义（t=0.07、0.12、0.53、0.39，P＜0.05）。说明炎性因子可以使AST活性增加，尤其是IL-1β与TNF-α合用时效果更加显著。

表1 聚合酶链式反应引物

图1 原代培养传至第4代的星形胶质细胞免疫荧光染色

2.3 炎性因子对AST内sPLA2-ⅡA表达的影响 选用10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组进行实验，设定对照组sPLA2-ⅡA的mRNA相对表达量为1，10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组sPLA2-ⅡA的mRNA相对表达量为（7.34±2.41）。因此，当10 ng/ml IL-1β和10 ng/ml TNF-α联合应用时，AST内sPLA2-ⅡA mRNA表达量显著升高（t=9.615，P＜0.05）。

对照组和10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组细胞培养24 h后，细胞内sPLA2-ⅡA蛋白分泌到上清液中，利用酶联免疫法检测上清液中sPLA2-ⅡA蛋白的分泌量。对照组上清液sPLA2-ⅡA蛋白表达量为（6.30±0.10）ng/ml，10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组为（8.02±0.23）ng/ml。因此，联合应用10 ng/ml IL-1β和10 ng/ml TNF-α能使AST内sPLA2-ⅡA的蛋白表达量显著升高（t=11.635，P＜0.05）。

2.4 炎性因子对AST内NF-κB、IKKα、IKKβ mRNA表达的影响 选取10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组进行实验，设定对照组AST内NF-κB、IKKα、IKKβ的mRNA相对表达量为1，10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α组的NF-κB、IKKα、IKKβ mRNA相对表达量分别为（1.46±0.20）、（2.35±0.49）、（1.83±0.22）。因此，联合应用10 ng/ml IL-1β和10 ng/ml TNF-α能使AST内NF-κB、IKKα、IKKβ mRNA表达量均显著升高（t=4.015、4.719、6.509，P＜0.05）。

3 讨论

炎性因子本质上是可溶性的多肽分子，它们和炎症反应有着紧密的关系。其中，促炎因子主要有IL-6、IL-1β、TNF-α等，抗炎因子主要有IL-4、IL-10、IL-13等[4]。TNF-α是在炎症反应中最早表达的炎性因子，由AST产生，能够促进、诱导多种炎症介质的产生[5]。在炎症反应中IL-6和IL-1β的增加将会加重炎症细胞的聚集，影响神经功能的恢复。IL-10具有抑制炎症的作用，它能够抑制炎性因子的合成，抑制炎症细胞的迁移等[6-7]。本实验首先在AST的培养基中分别加不同浓度组合的炎性因子，24 h后利用CCK-8检测AST的活性变化。CCK-8结果表明，上述组合均能活化AST，其中10 ng/ml IL-1β和10 ng/ml TNF-α联用效果最显著，说明炎性因子能够引起AST的活化。

将10 ng/ml IL-1β与10 ng/ml TNF-α同时加至培养基中24 h，通过qRT-PCR和ELISA检测IKKα、IKKβ、NF-κB、p65和sPLA2-ⅡA的表达量变化，结果发现sPLA2-ⅡA、IKKα、IKKβ、NF-κB、p65的表达量均升高，说明促炎因子能够促进炎症的发生。

有研究表明，NF-κB信号通路参与了一系列的基因转录[8-10]。与实验结果一致，本实验中通过qRT-PCR和ELISA检测到当有炎性因子存在时，AST活化同时NF-κB表达增多，其上游的IKKα、IKKβ表达量亦增多。因此，NF-κB是能够启动多种炎症介质基因表达的关键转录因子[11]。另外，有研究表明在IKKβ敲除的小鼠中，NF-κB表达量显著降低[12]。说明IKKβ在IKK复合物中可能起主要作用。

sPLA2-ⅡA分布广泛，哺乳动物细胞、蜂毒和蛇毒中均存在。在sPLA2的亚型中，受人们关注的是sPLA2-ⅡA和它的抑制剂[13-16]。sPLA2-ⅡA和sPLA2-ⅤA均在脑组织中表达[17-18]，sPLA2-ⅡA研究较sPLA2-ⅤA多，是因为其参与了炎症反应[19-20]。sPLA2-ⅡA能够介导固有免疫和获得免疫，并在很多炎症性疾病中表达量增多[16，21]。sPLA2-ⅡA表达增多在大鼠缺血性卒中已得到验证[22]。另外，体外实验还表明sPLA2-ⅡA在神经元活动中起重要作用[23-25]。在本实验中，通过qRT-PCR和ELISA的方法得出结果，炎性因子刺激后sPLA2-ⅡA表达量增多，说明炎性因子作用于AST后，AST活化，进而引起sPLA2-ⅡA表达量增多，水解膜磷脂的Sn-2位酯酰基，产生溶血卵磷脂和游离脂肪酸。溶血卵磷脂和游离脂肪酸不能及时代谢，发生聚集并形成类花生酸，进一步产生炎症介质，从而导致炎症级联反应的发生。NF-κB的表达量增高的同时sPLA2-ⅡA表达量增高，说明炎性因子介导的AST sPLA2-ⅡA产生很有可能是通过IKKα/IKKβ-NF-κB-sPLA2-ⅡA通路进行的。当然，这需要更多的研究来证明确切的机制。

本次研究仅仅初步讨论了在炎性因子作用下，AST的活性变化以及sPLA2-ⅡA表达量变化和其可能存在的内在机制，为神经系统疾病发生发展过程中的炎症反应提供了一些实验依据，更多的机制探讨有待更深一步的研究。