胸苷酸合成酶和二氢嘧啶脱氢酶的表达与乳腺癌临床病理特征及预后的相关性

迪丽拜尔·吾守，艾克白尔江·艾尼瓦尔，木合塔尔·吾布力卡斯木，祖丽比亚·司马义，艾斯卡尔·艾沙

（喀什地区第二人民医院1.普外科，2.科教部，3.急诊外科，新疆 喀什844000）

5-氟尿嘧啶（5-FU）作为乳腺癌术后化疗的常用药物，可明显提高患者生存时间，但患者对药物敏感性和毒副反应存在个体差异，会影响化疗效果［1-2］。胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）为5-FU的作用靶点，而二氢嘧啶脱氢酶（dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD）为5-FU的分解代谢限速酶，这两种酶的表达水平是影响5-FU疗效的关键［3］。但目前有关两者与乳腺癌相关性的研究较少。因此，本研究旨在探讨TS和DPD表达与乳腺癌患者临床病理特征和预后的相关性，以期为乳腺癌患者制定合理的个体化化疗方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本收集

筛选2015年1月至2018年1月于喀什地区两家三甲医院乳腺外科行乳腺癌切除术的女性患者60例，年龄24～69岁，中位年龄49岁。乳腺癌组织学分类参考WHO乳腺肿瘤组织学分类（2003）标准，髓样癌11例，浸润性导管癌40例，浸润性小叶癌9例。所有患者术前均未接受放疗和化疗，术后接收以5-FU为基础的化疗，收集的肿瘤组织及癌旁组织（肿瘤距离＞5 cm）样本固定于10%中性多聚甲醛中，用于病理切片检查。

1.2 试剂与仪器

单克隆鼠抗人TS抗体、多克隆兔抗人DPD抗体（英国Abcam公司）；山羊抗鼠、山羊抗兔IgG抗体（广州市格瑞林生物科技有限公司）；LEICA RM2025组织切片机（德国Leica公司）；HD-330生物组织摊片烤片机（湖北慧达仪器有限公司）；KD-BM生物组织包埋机（北京佳源兴业科技有限公司）；KL-R生物组织自动染色机（湖北康龙电子科技公司）。

1.3 免疫组化法检测TS和DPD蛋白的表达

将肿瘤组织和癌旁组织石蜡包埋后，制作厚度4μm的切片，60℃烤片1～1.5 h，二甲苯浸泡脱蜡，梯度乙醇水化，修复抗原［高压锅加入0.01mol／L枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0），锅盖不锁定，缓慢加压，5 min后锁定锅盖，10 min后除去热源，自来水冲洗降温］，3%H2O2室温孵育10 min，10%胎牛血清封闭10min，加入TS或DPD抗体（TS1∶20，DPD 1∶100）4℃孵育过夜，山羊抗鼠或抗兔IgG抗体室温孵育20 min，链霉素 辣根过氧化物缓冲液孵育20 min，二氨基联苯胺染色。中性树脂封片后，显微镜下观察TS和DPD蛋白的表达。

1.4 结果评价

100×视野下观察细胞着色，着色部位主要集中于细胞质，根据着色面积和强度进行综合评价，着色面积为无着色、≤25%、25%～50%、≥50%分别记0、1、2、3分；着色强度为无着色、低度着色、中度着色、高度着色分别记 0、1、2、3分；计算两项计分之和，≤2分为阴性表达，＞2分为阳性表达。

1.5 统计学分析

采用SPSS 11.0软件进行统计分析，数据结果以频数或率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义；并采用了多因素回归分析，研究年龄、腋下淋巴结转移、TS以及DPD的蛋白表达与喀什地区乳腺癌患者预后的相关性。

2 结果

2.1 乳腺癌组织和癌旁组织TS和DPD的表达

免疫组化染色结果显示，60例乳腺癌癌组织中TS和DPD蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织（P均＜0.05）。见图1和表1。

表1 乳腺癌癌组织和癌旁组织中TS和DPD的表达例，n＝60

2.2 肿瘤组织中TS和DPD表达与临床病理特征的关系

由表2可知，乳腺癌肿瘤组织中TS表达与临床分期、组织分化程度和淋巴结转移显著相关（P＜0.01或P＜0.05），而与年龄、肿瘤直径和组织学分类无相关性（P均＞0.05）。DPD表达仅与淋巴结转移显著相关（P＜0.05），而与年龄、肿瘤直径、临床分期、组织分化程度和组织学分类无相关性（P均＞0.05）。

表2 乳腺癌组织中TS和DPD表达与临床病理特征的关系

2.3 TS、DPD的表达与患者生存时间的关系

Kaplan-Meier分析结果显示，TS阳性表达的乳腺癌患者生存时间比阴性患者明显缩短（χ2＝4.502，P＝0.034），而 DPD表达与患者生存时间无显著相关性（χ2＝0.417，P＝0.519）。TS阴性患者5年存活率为72.73%，明显高于阳性组（51.82%，χ2＝4.355，P＝0.037）；DPD阴性和阳性表达患者 5年存活率分别为67.35%和72.34%，差异无统计学意义（χ2＝0.284，P＝0.594）。见图 2。

为了进一步验证肿瘤组织中TS和DPD表达与生存时间的关系，本研究又采用了多因素回归分析。结果显示，年龄、腋下淋巴结转移、TS以及DPD的回归系数均为正值，表明4者与术后生存率呈负相关，与死亡率呈正相关，是危险因素，即年龄大、发生腋下淋巴结转移、TS蛋白表达高者生存期短，4者是独立的预后因素。根据相对危险度，TS对预后的影响最大，其次为淋巴结转移。见表3。

图2 乳腺癌组织中TS和DPD表达与生存时间的关系

3 讨论

TS是催化尿嘧啶脱氧核苷甲基化为胸腺嘧啶脱氧核苷的限速酶，而胸腺嘧啶脱氧核苷是合成和修复DNA所必需的，在细胞生长过程中发挥重要作用［4］。DPD是一类二聚体蛋白酶，主要参与催化嘧啶核苷酸的分解代谢，同时也是氟尿嘧啶类抗肿瘤药物体内分解代谢的起始和限速酶［5］。5-FU、替加氟、替吉奥、卡培他滨等都属于氟尿嘧啶类药物，而后3种药物在体内发挥抗肿瘤作用的有效成分均为5-FU［6］。5-FU作为一种嘧啶衍生物，其代谢产物能与TS结合并抑制其活性，遏制胸腺嘧啶脱氧核苷的从头合成，引发细胞核酸代谢紊乱，从而造成肿瘤细胞死亡［7］。

表3 60例乳腺癌患者多因素预后分析

近年来，关于多种肿瘤组织中TS和DPD表达与肿瘤临床病理参数、5-FU化疗敏感性及预后等方面的研究较多，但研究结果存在争议。目前还缺乏大规模临床试验进行验证［8-10］。国内余之刚等［11］的研究显示，TS与胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶表达水平的高低有可能是乳腺癌患者一个重要的预后指标；而DPD的表达与临床病理因素、10年无病生存和总生存率之间无任何相关性。Horiguchi等［10］对浸润性乳腺癌组织中DPD表达的研究显示，与DPD阴性表达患者相比，DPD阳性表达患者的生存预后较差，并且DPD还可作为5-FU或5-FU衍生物治疗患者的预后因子。但是，Hakamada等［12］对5-FU化疗的乳腺癌患者的研究表明，肿瘤组织中DPD表达与患者5年生存率无显著性相关。在本研究中，肿瘤组织中DPD阳性表达亦显著高于癌旁组织，但其表达仅与淋巴结转移显著相关（P＜0.05），而与肿瘤直径、临床分期、组织分化程度、生存时间和5年存活率等均无相关性；而TS蛋白水平不仅显著高于癌旁组织，而且还与临床分期、组织分化程度、淋巴结转移、生存时间以及5年存活率显著相关。这与Yu等［13］的研究结果基本一致。

本研究中多因素回归分析结果显示，年龄、腋下淋巴结转移、TS以及DPD的表达均与患者的预后相关，并且TS对预后的影响最大，其次为淋巴结转移，而DPD对乳腺癌患者预后的影响最小。

综上所述，乳腺癌组织中TS和DPD阳性表达异常增加，均具有作为乳腺癌辅助诊断指标的可能性，但DPD表达仅与乳腺癌转移显著相关，而TS与乳腺癌多种临床病理特征和预后显著相关。所以TS表达可能具有成为5-FU化疗对乳腺癌疗效的预测参数的潜力，甚至作为乳腺癌临床预后的预测因子。但由于本研究中的样本量偏少，为保证研究的可靠性和科学性，下一步还需要收集更多的样本进行研究。