EGCG对富亮氨酸重复激酶2活性的影响及其作用机制

钮婧歆，郭晶，郭青，李杰，刘珺，*，刘朝晖，*

（1.苏州大学医学部人体解剖与组织胚胎学系，江苏苏州215123；2.连云港中医药高等职业技术学校基础医学教研室，江苏连云港222007；3.苏州卫生职业技术学院基础医学教研室，江苏苏州215009）

帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，常染色体显性基因富亮氨酸重复激酶2（leucine rich repeat kinase 2，LRRK2）基因突变是其发病的主要原因。LRRK2基因突变后导致黑质致密部多巴胺能神经元丢失和神经元内路易氏小体沉积。以往研究表明，由遗传性突变LRRK2结构域第2019位点氨基酸残基G2019S突变（LRRK2-G2019S）引起的激酶活性增强是导致多巴胺能神经元损伤的重要机制［1］。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是一种可穿越血脑屏障的中药单体，能有效保护脑组织，抑制6-羟多巴胺诱导的神经细胞死亡［2］，还能抑制帕金森病神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）引起的 αsyn聚集和多巴胺能神经元损伤［3］。此外，EGCG还具有非常强的抗氧化活性［4］。氧化应激是帕金森病发病的重要原因［5］，由此推测EGCG对多巴胺能神经元的保护作用可能与其抗氧化活性有关。体内外实验均表明，蛋白激酶C信号通路与LRRK2激酶活性密切相关［6］。EGCG对蛋白激酶C信号通路有抑制作用，但其对LRRK2激酶活性是否具有抑制作用尚不清楚。本研究拟探讨EGCG对LRRK2激酶活性的作用及其对果蝇生物学行为的影响和相关分子信号机制。

1 材料与方法

1.1 材料

UAS-LRRK2-G2019S品系果蝇为约翰霍普金斯大学Wanli Smith教授实验室赠送，通过和GAL4杂交获得 Ddc-Gal4／LRRK2-G2019S品系果蝇（简称Ddc-G2019S）。EGCG（上海源叶生物科技有限公司）；LRRK2激酶抑制剂GW5074（美国APExBIO公司）；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）抗氧化剂（上海碧云天生物技术有限公司）；鼠抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）单抗（美国 Sigma公司）；兔抗p-LRRK2单克隆抗体（美国Abcam公司）；兔抗核因子E2相关因子2（Nrf2）单克隆抗体（美国 Aviva Systems Biology公司）；小鼠抗 β-微管蛋白单克隆抗体、兔抗p-p38 MAPK单克隆抗体、兔抗p-ERK单克隆抗体（苏州睿瀛生物技术有限公司）；小鼠抗TH单克隆抗体（Millipore公司）。

1.2 果蝇培养基的配制

先配制果蝇标准玉米培养基，用于Ddc-G2019S对照组果蝇培养；再取适量加入不同药物，配成不同加药组果蝇培养基。具体操作：①称取琼脂3.3 g，蔗糖25 g放入盛有300 mL冷水的烧杯中，完全溶解后置于加热磁力搅拌器上；②称取酵母12 g放入上述烧杯中，完全溶解后加入玉米粉30 g，搅拌均匀；③待溶液沸腾5 min后停止加热；④待温度降至75℃左右时，加入尼泊金甲酯溶液3 mL，丙酸1.5 mL，搅拌均匀；⑤ 温度降至适宜时取一部分灌装果蝇食物管，此为果蝇标准玉米培养基；⑥ 取50 mL培养基 6份，分别加入 10 mmol／L GW5074，10mmol／LNAC，100μmol／L EGCG，1、10和100mmol／L EGCG各50μL，混匀，灌装果蝇食物管，即为加药培养基，药物浓度分别为10μmol／L GW5074，10μmol／L NAC，0.1、1、10和 100μmol／L EGCG。

1.3 实验分组

将Ddc-G2019S果蝇分为7组：对照组采用标准玉米培养基饲养；GW5074组采用含 10μmol／L GW5074的培养基饲养；NAC组采用含10μmol／L NAC的培养基饲养；其余4组分别采用含0.1、1、10和100μmol／L EGCG的培养基饲养；每组各6管，共42管；每管置入处女蝇25只，于25℃，相对湿度60%环境下饲养。

1.4 果蝇生命周期及行为学检测

各实验组每管置入处女蝇25只，每组至少2管果蝇，每隔2天换1次培养基。每天统计果蝇存活数，直至果蝇全部死亡。

待处女蝇发育成熟后，开始每周1次行为学检测，检测果蝇运动能力。成熟果蝇有沿行为学测试管管壁向上攀爬的生物学特性，以10 s内越过测试管中线的果蝇数量占管内果蝇总数的百分率来表示果蝇运动能力，数值越高表明整组果蝇运动能力越强。具体操作：在未麻醉情况下，将各组的每管果蝇分别转移至另一空培养管中，静置2～3 min，使之适应环境改变；轻拍管壁使之全部落在管底，统计10 s内爬过行为学测试管中线的果蝇数量；取3次实验平均值，每两次实验间隔5 min。

1.5 蛋白质印迹法检测果蝇脑蛋白的表达

依据果蝇生命周期和行为学检测结果，筛选出10μmol／L EGCG组，1μmol／L EGCG组，10μmol／L GW5074组，10μmol／L NAC组，与对照组进行比较。在药效最显著的时间段，取各组果蝇脑组织，分析各种蛋白的表达。具体操作如下。

CO2麻醉后，在显微镜下，用尖头镊和刀片取果蝇脑组织，每组取4个，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上研磨，静置裂解30 min；4°C，12 000 r／min离心15 min，取上清液。BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，调整上样量，使各组蛋白总量一致；加入5×上样缓冲液，100℃煮沸5 min使蛋白质变性。-80℃保存备用。

制备分离胶、浓缩胶，行SDS-PAGE分离蛋白；转至PVDF膜；室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h；将PVDF膜按一抗蛋白分子量剪开放入对应的一抗稀释液中（p-LRRK2，Nrf2，p-ERK1／2，p-p38 MAPK，TH稀释比均为1∶800，β-微管蛋白稀释比为1∶1 000，TBST为抗体稀释液），4℃孵育过夜；用1×TBST洗膜3次；加入二抗（稀释比均为1∶2 000），室温孵育2 h；洗膜后在暗室中加入发光剂，成像系统显影。采用Image J软件处结果图像。

1.6 统计学处理

采用GraphPad Prism 6.0软件作图并用单因素方差分析和Bonferroni事后检验法进行统计学分析。实验结果以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组果蝇生命周期比较

与对照组相比，各组果蝇存活率从第3周开始出现差异，第4周差异进一步扩大，第5周时各组存活率出现较大下降。与对照组相比，10μmol／L EGCG组提高存活率效果始终最明显，与GW5074组相近，且在第 5、6、7周优于 GW5074；1μmol／L EGCG组效果相对较好，但第6、7周效果明显下降。与对照组相比，NAC组果蝇存活率提高，总体作用虽不如GW5074组和10μmol／L EGCG组，但在第 6、7周表现较好；100μmol／L EGCG和 0.1 μmol／L EGCG对果蝇有一定保护作用，但效果不及其余4组，与对照组差异始终不明显。见图1。

与对照组相比，GW5074组、10μmol／L EGCG组和1μmol／L EGCG组半数生存时间明显延长（P＜0.01），NAC组、100μmol／L EGCG组和 0.1 μmol／L EGCG组半数生存时间有一定延长（P＜0.05）。进一步印证选用10μmol／L和1μmol／L的EGCG延长果蝇寿命效果较好，0.1、100μmol／L EGCG作用不明显。见图1。

图1 果蝇的生命周期检测结果

2.2 果蝇行为学的变化

由图2可见，7组果蝇运动能力在第5周发生较大变化。与对照组相比，10μmol／L EGCG组、1 μmol／L EGCG组与 GW5074组第 4、5、6、7周运动能力均明显提高（P＜0.05），第5周时最明显（P＜0.01）；NAC组在第 4、5、6周运动能力也有不同程度的提高（P＜0.05），第5周时最明显（P＜0.01）；0.1μmol／L EGCG组仅在第4周时差异有统计学意义（P＜0.05）；100μmol／L EGCG组与对照组相比，差异均无统计学意义。

结果表明，与对照组相比，10μmol／L EGCG改善果蝇运动能力的效果最为突出，1μmol／L EGCG效果较好，0.1、100μmol／L EGCG作用不明显，各组果蝇第5周时行为学变化最显著。

图2 果蝇运动能力检测结果

2.3 EGCG作用后果蝇脑内蛋白表达的变化

由图3可见，与对照组相比，10μmol／L和1 μmol／L EGCG组果蝇脑内 Nrf2、p-ERK1／2、TH蛋白表达均明显增加（P＜0.05或0.01），p-LRRK2、p-p38 MAPK蛋白表达明显降低（P＜0.05或0.01）。与对照组相比，GW5074组和NAC组果蝇脑内p-ERK1／2、TH蛋白表达明显上调（P＜0.05或0.01），GW5074组 p-LRRK2和 p-p38 MAPK蛋白表达明显下调（P＜0.01）。NAC组Nrf2表达明显增加（P＜0.01），两种浓度的EGCG均能促进Nrf2表达，而1μmol／L EGCG作用效果更佳，低浓度EGCG促进Nrf2表达的作用更强，表明EGCG具有很强的抗氧化活性。GW 5074没有明显的抗氧化作用。

3 讨论

本研究采用人源性LRRK2-G2019S突变转基因果蝇，其脑内LRRK2激酶活性增高，是探究EGCG是否具有抑制LRRK2激酶活性作用的良好模型。本研究表明，EGCG能显著延长LRRK2-G2019S转基因果蝇寿命，改善果蝇运动能力，以10μmol／L作用效果最显著，1μmol／L效果较好；各组果蝇第5周时行为学变化最显著；此外，EGCG能增加果蝇脑内 Nrf2、p-ERK1／2、TH蛋白表达，降低 p-LRRK2、pp38 MAPK表达，表明EGCG能有效抑制LRRK2激酶活性，有较好的抗氧化活性，进而保护多巴胺能神经元；其机制可能与Keap1-Nrf2-ARE和MAPK信号通路有关。在Keap1-Nrf2-ARE信号通路中，EGCG通过激活Nrf2，引起Nrf2核转移，继而提高谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）基因表达，增加谷胱甘肽合成［7］，产生抗氧化作用，从而提高Ddc-G2019S转基因果蝇脑内多巴胺能神经元的抗氧化应激能力［8］；在MAPK信号通路中，EGCG通过抑制p38磷酸化和（或）激活ERK1／2抑制细胞凋亡，进而保护多巴胺能神经元。

在哺乳动物中，有4个MAPK信号途径与帕金森病有关，分别是 ERK1／2，p38 MAPK，JNK及ERK5［9］。p38 MAPK、JNK与 LRRK2也有相关性，但是三者与帕金森病之间的关系尚不明确。在应激状态下，LRRK2可激活p38 MAPK和MKK7参与JNK信号途径，导致细胞凋亡［10］。ERK1／2参与LRRK2突变引起的神经退化的信号途径［11］。有研究报道，EGCG对MAPK通路也具调节作用，可能通过干预体内p38 MAPK信号通路抑制脂多糖诱导巨噬细胞表达TNF-α［12］。本研究结果显示，与对照组相比，EGCG组p-LRRK2表达明显降低，表明其对LRRK2激酶活性具有抑制作用；同时，EGCG组p-ERK1／2、p-p38 MAPK表达明显增加，由此提示，EGCG可能通过降低LRRK2突变导致的激酶活性，间接调控p38 MAPK的磷酸化或活化ERK，进而对多巴胺能神经元起到保护作用。

本研究结果显示，EGCG也能同时增加果蝇脑内Nrf2和TH表达量。Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子，受Keap1调控，通过与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）相互作用调节抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶表达［13］。Keap1-Nrf2-ARE信号通路是机体抗氧化机制中最重要的一条信号通路［14］。GCLC是 Nrf2调控的下游抗氧化酶［15］，经 Nrf2转录调节促进谷胱甘肽的合成［7］。现已证实，帕金森病患者黑质中谷胱甘肽减少约50%，从而致多巴胺能神经元易受到多种毒性物质的损伤［8］。研究表明，EGCG可通过诱导 GCLC基因表达提高肝星状细胞胞质和线粒体谷胱甘肽的水平［16］。本研究结果显示，与对照组相比，EGCG组果蝇脑内Nrf2表达增加，提示EGCG可能通过激活Nrf2，引起其核转移，继而上调GCLC基因表达，增加果蝇脑内谷胱甘肽的合成，增强细胞抗氧化应激能力，从而保护多巴胺能神经元免受帕金森病诱导刺激的影响，但具体作用机制还有待进一步研究。

图3 各组果蝇脑内相关蛋白的表达

本研究中，EGCG对LRRK2激酶活性抑制作用虽稍弱于GW5074，但其本身还具有很强的抗氧化活性，双重作用使EGCG较GW5074更具有作为帕金森病治疗药物的潜力。EGCG作为一种中药单体是天然提取的化合物，来源广，安全性高，具有很大的市场价值。目前关于EGCG产生LRRK2激酶活性抑制作用的信号通路研究并不完善，还有待于后续研究进一步探索。本实验室已培育了一批LRRK2-G2019S系转基因小鼠，将药物用于转基因小鼠的生物学研究，联合应用果蝇与小鼠，发挥各自的优势，能更好地指导临床药物选择，同时也为中草药制剂的治疗作用机制添加更多科学、客观的实验资料。

综上所述，EGCG是一种有效的LRRK2激酶活性抑制剂，具有多巴胺能神经元保护作用，可能与其调控Keap1-Nrf2-ARE、MAPK等信号传递有关。