URI在胃癌组织的表达及对顺铂诱导的胃癌细胞凋亡的影响

卞慧琴，谷雨，2，陈瑾楠，王倩，吕耀娟，郑其平，谷俊侠

（1.江苏大学医学院，江苏镇江212013；2.江苏大学附属人民医院血液科，江苏镇江212001）

胃癌是全球高发的恶性肿瘤，据统计，2013年全球约有84万人死于胃癌，其中发展中国家占77%，且主要集中于中国［1-2］。胃癌确诊时很多已属中晚期，主要采用手术联合化疗进行治疗。由于化疗耐药的产生，患者术后复发和转移率高，预后不良［3］。前折叠素家族（PDFs）的非传统成员非经典前折叠素RPB5相互作用因子（unconventional prefoldin RPB5 interactor，URI）是一个多功能蛋白，影响细胞的多种生物学行为，如真核基因转录及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）营养敏感通路的调控、维持基因组DNA稳定性等［4-7］。近年发现 URI具有癌基因的特性［8-11］。我们前期的体外实验证实URI能促进胃癌细胞的增殖与迁移，增强对多柔比星的耐药性，促进肿瘤细胞存活［12］。这提示URI在胃癌细胞中起癌蛋白的作用。一个原癌基因是否在某种肿瘤中发挥作用，需要有该基因在肿瘤组织中扩增或突变的依据。URI在胃癌组织中是否扩增及过度表达目前并不清楚。本研究应用胃癌组织芯片检测了胃癌组织URI的表达并分析其与临床特征的相关性，并通过体外实验分析URI对顺铂诱导的胃癌细胞凋亡的影响，以探讨URI在胃癌发生发展中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织芯片及细胞株 胃癌生存期组织芯片（HStm-Ade180Sur-09）购自上海芯超生物科技有限公司。芯片包含90例手术切除病理确诊为胃癌患者的组织标本，包括胃腺癌84例，其中黏液腺癌3例，腺癌中含部分印戒细胞癌5例，腺癌中含部分黏液腺癌2例；印戒细胞癌5例，其中伴部分黏液腺癌1例；高级别上皮内瘤、癌变1例（此例为瘤和癌都含有的病例，取样点经病理确认为癌变组织）。每例癌和癌旁组织各一个点，共180个点。

90例患者术前均未接受化疗放疗，其中男67例，女21例，年龄44～86岁，平均年龄67.3岁。病理分级：Ⅰ、Ⅱ级28例，Ⅲ级61例；肿瘤直径：＞5 cm 47例，≤5 cm 40例；胃癌转移64例，未发生转移24例；TNM分期：TNM1、TNM2共33例，TNM3、TNM4共48例；手术时间在2009年12月至2010年6月，随访至2016年6月，随访期间死亡病例60例，生存病例30例；其中缺失的病例为资料不详的病例。

人胃癌细胞株MGC-803和SGC-7901由江苏大学朱伟教授赠予。

1.1.2 主要试剂及仪器 DMEM培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（以色列 BI公司）；兔抗人URI单克隆抗体（美国 Proteintech公司）；小鼠／兔IgG-SABC免疫组化染色试剂盒（SA 1020）、DAB显色试剂盒（AR1022）和 Mayor's苏木素（AR0005）购自武汉博士德生物公司；Hiperfect转染试剂（美国QIAGEN公司）；URI siRNA-A片段（前期从siRNAA、siRNA-B、siRNA-C中筛选出来的干扰效果最好的片段）、无关序列片段（苏州吉玛公司）；顺铂（美国Selleckchem公司）；流式细胞仪、FITC Annexin-V凋亡检测试剂盒（美国BD公司）；兔抗人GAPDH抗体（苏州睿瀛公司）；HRP标记羊抗兔IgG（美国CST公司）；荧光定量PCR试剂盒、荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；凝胶成像系统（Gene公司）。

1.2 方法

1.2.1 组织芯片URI检测 采用辣根过氧化物酶法进行组织芯片免疫化学染色，主要步骤：60℃烤片；二甲苯及梯度乙醇脱蜡；枸橼酸盐缓冲液热修复；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶；5%BSA封闭液37℃湿盒封闭；4℃湿盒一抗孵育过夜；37℃湿盒二抗孵育；SABC放大；DAB显色，见明显棕色即终止；苏木素复染；脱水；中性树脂立即封片。

组织芯片中URI的表达量由病理学专家在未知URI蛋白性质的情况下盲法进行镜检分析获得，高倍镜（400×）下每个组织点随机选取5个视野计数目标细胞并评分，胃癌组织中选取上皮组织癌细胞计数，癌旁组织中选取正常上皮和良性腺瘤细胞计数，分别判读URI的胞质、胞核染色的染色强度和染色阳性率。细胞染成淡黄色至棕黄色即判断为阳性，染色强度评分标准：阴性为0分；1+为1分；2+为2分；3+为3分。染色阳性率评分标准：阴性为0分，1% ～25%为1分；26% ～50%为 2分；51%～75%为3分；76%～100%为4分。最后以“染色强度评分”和“染色阳性率评分”的乘积为总评分进行分组，胞质表达总评分≤6为低表达组，总评分＞6为高表达组；胞核表达总评分≤0为低表达组，总评分＞0为高表达组。

1.2.2 细胞培养 胃癌细胞 MGC-803和 SGC-7901在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于含5%CO2的37℃培养箱中恒温培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.3 细胞转染 取状态良好的对数生长期细胞接种于6孔板，将细胞分为空白组、无关序列组和siRNA URI干扰组，待细胞融合率达70%左右时，无关序列组和siRNA URI干扰组经Opti-MEM与Hiperfect转染试剂混合物分别转染无关序列片段和URI siRNA-A干扰片段，空白组加入等体积Opti-MEM培养基，混匀后置于5%CO2、37℃培养箱中培养。24 h或48 h后提取RNA或蛋白进行后续实验。

1.2.4 qRT-PCR检测转染后细胞URImRNA表达量 细胞转染24 h后收取各组细胞，按照RNA提取步骤提取RNA，紫外分光法测定RNA浓度，根据RNA浓度计算出逆转录所需RNA体积，DNA酶处理后以25℃5 min，42℃30 min，85℃5min反应条件逆转录合成cDNA。将含有2μL cDNA的20μL逆转录体系进行扩增，反应条件为95℃热启动3 min，95℃变性10 s，56℃退火延伸30 s，其中变性和退火延伸共40个循环。扩增产物的特异性由溶解曲线判定，相对定量分析采用2-△△CT法分析。每次实验取3个复孔平均值，取3次独立实验的结果应用GraphPad Prism 7.0进行分析，并绘制柱状图。

1.2.5 蛋白质印迹法检测URI蛋白表达 细胞转染48 h后收集细胞，加入提前配制的细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，测定浓度；加入5×上样缓冲液和β-巯基乙醇混合物煮沸变性，置于-20℃保存。配制10%聚丙烯酰胺凝胶；提取的蛋白以70 V电泳至标准参照物分开后，再以100 V电泳至结束；4℃条件下350 mA恒流电转膜90 min；5%脱脂牛奶封闭1 h；加入兔抗人URI抗体（1∶1 000）和兔抗人GAPDH抗体（1∶3 000），4℃孵育过夜；TBST洗膜15 min，重复3次；加入兔二抗（1∶5 000），37℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15 min；ECL显影凝胶成像系统检测结果，每组实验至少重复3次。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期两类胃癌细胞接种于6孔板，分别设定空白组、siRNA URI干扰组以及顺铂处理的未转染组、无关序列组、siRNA URI干扰组，待细胞融合率达50%～70%时进行细胞转染，48 h后加入含顺铂的培养基诱导细胞凋亡。通过预实验我们选择在细胞多数存活的情况下能导致细胞DNA最大限度损伤的顺铂浓度诱导细胞凋亡，MGC-803细胞为 10μmol／L、SGC-7901细胞为5μmol／L，作用12 h。

胰酶消化细胞收集于EP管，PBS洗涤细胞，取约1×106个细胞，重悬于1 mL 1×结合缓冲液中，混匀后取100μL细胞至流式管中，依次加入5μL FITC AnnexinV和PI，室温避光孵育15 min，检测前每管中加入400μL 1×结合缓冲液，以阳性单染细胞作为对照，1 h内检测，每组实验重复3次。

1.3 统计分析

应用SPSS 22.0进行统计分析。通过配对非参数Wilcoxon检验法分析URI在癌及癌旁组织间的表达差异；URI的表达与临床特征间关系的分析采用Fisher确切概率法；生存率比较采用log-rank检验；多组数据分析采用Levene进行方差齐性检验，若方差齐，则用单向方差分析，若有统计学意义，则进行两两之间比较，两两之间比较采用Bonferroni进行校正，否则用非参数分析，数据用均值±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 URI在胃癌组织的表达及其与临床特征的关系

由于实验过程中脱片、取材等因素的影响，芯片中6例组织点无法判读，最终结果由84例病例共168个点判读统计所得。90例中6例癌和癌旁共12个点被排除，包括 A1，E3，F5，A9，H15，J13点及其对应的癌旁点（图1）。

图1 胃癌组织芯片判读范围

统计结果表明，URI在胃癌组织细胞胞质中的表达明显高于癌旁组织（P＜0.05），胃癌组织细胞胞核URI染色总评分均值比癌旁组织高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1和图2。

表1 URI在胃癌及癌旁组织表达的差异性n＝84

进一步分析显示，URI在胃癌组织细胞胞质中的表达与患者性别相关（P＜0.05），而与年龄、肿瘤大小、病理分级、有无转移及TNM分期等无关（P＞0.05），见表2。采用log-rank检验对胃癌患者URI高、低表达组间的生存率进行比较，结果显示，胃癌组织胞质（χ2＝1.888，P＞0.05）及胞核（χ2＝3.587，P＞0.05）URI高、低表达组间患者生存率差异均无统计学意义。

图2 胃癌及癌旁组织URI的IHC染色（×400）

表2 胃癌组织URI表达与临床特征的关系

2.2 URI基因敲低细胞株的验证

qRT-PCR结果显示，URI siRNA-A片段转染24 h后，两种细胞株URImRNA的表达较无关序列转染组显著降低（P＜0.01，图3A）；蛋白质印迹检测结果显示，URIsiRNA-A片段转染48 h，细胞URI蛋白的表达显著低于无关序列组（P＜0.01，图3B）。以上结果表明URI基因敲低表达的两类胃癌细胞株构建成功。

2.3 敲低URI促进顺铂诱导的细胞凋亡

流式细胞术检测结果显示，在MGC-803（图4）和SGC-7901（图5）两株细胞中，未经顺铂处理时，URI siRNA组细胞凋亡率与空白组相比无显著性差异；经顺铂诱导后，URIsiRNA组相较于无关序列组凋亡比例（早期凋亡+晚期凋亡）明显增加（P＜0.01）。

图3 两类胃癌细胞URIm RNA和蛋白的表达

图4 URI对MGC-803胃癌细胞凋亡的影响

图5 URI对SGC-7901胃癌细胞凋亡的影响

3 讨论

哺乳动物的URI高度保守，广泛存在于细胞胞质、胞核和线粒体中［5，13］，并参与组成多种蛋白复合物［4，14］。目前认为URI参与了营养敏感的mTOR通路的调节，但对其与疾病的关系所知甚少。最早基于卵巢癌和肝癌的研究提示URI是一个癌基因［8-9］。我们参与了肝癌的研究［9］，此后我们对宫颈癌和胃癌细胞的研究也支持URI具有癌蛋白性质［12，15-16］。原癌基因的扩增或表达活性的增强是癌基因活化的一种机制，本研究中我们发现URI在胃癌组织细胞胞质中的表达明显增加，提示URI同胃癌的发生发展有关。真核细胞中普遍存在PI3K／AKT／mTOR通路，该通路的活化状态影响细胞多种重要生理过程，AKT磷酸化后作用于多种下游底物，包括 mTOR、survivin、Bcl-2、BAD等，影响细胞生长代谢、增殖、凋亡及细胞周期等［17］。URI是mTOR信号通路的磷酸化的靶，参与了对雷帕霉素敏感的信号通路转录的调节。研究发现URI在卵巢癌高表达，并通过抑制PP1γ的活性，持续活化mTOR下游通路，并通过负反馈系统增强S6K1的生存信号，促进卵巢癌细胞的生存，抑制凋亡［8］。mTOR感受营养状态、调节细胞生长的作用主要在胞质中进行，因此我们推测URI主要在胞质中与mTOR通路相互作用，而不是作为转录因子在胞核中发挥作用。

URI的高表达同患者生存期及年龄、肿瘤大小、病理分级、转移、TNM分期等没有显著相关性，提示URI可能主要涉及胃癌的发生机制而不影响胃癌预后。而胃癌组织胞质URI的表达在男女性之间差异有统计学意义，其意义有待进一步研究。Tummala等［10］的动物实验已证实URI参与了肝癌发生机制。持续表达外源性URI的小鼠在8周时出现不同程度肝纤维化，24～54周时出现肉眼可见的腺瘤和早期肝癌，但在第8周停止小鼠URI表达后小鼠肝纤维化减轻，同时肝癌的形成受到抑制，表明URI的持续表达可促进癌前病变和早期肝癌的发生。

原癌基因激活后可通过抑制细胞凋亡、促进细胞存活使细胞发生恶性转化。其中Bcl-2是重要的抑凋亡基因，而Bax的激活促进细胞凋亡。在凋亡信号刺激下，凋亡通路的Caspase-3激活，切割聚腺苷二磷酸 核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP），诱发凋亡。本实验室前期研究中发现在多柔比星作用下，URI能增强Bcl-2的表达并降低Bax的水平，并能增加 Cleaved Caspase-3和 Cleaved PARP-1的水平［12］。顺铂是胃癌化疗常用药物，其导致的DNA双链和单链断裂将诱导细胞凋亡。通常各种因素导致的DNA损伤将激活细胞周期检查点，使细胞阻滞在G1期，以便修复DNA损伤，如损伤不能修复，细胞将发生凋亡［18］。如果受损细胞不能经凋亡清除，DNA损伤的积累有可能使细胞发生恶性转化形成肿瘤。我们通过在两株胃癌细胞中敲低URI的表达，发现URI也能够抑制顺铂诱导的胃癌细胞凋亡，进一步显示URI可能通过抑制或减少细胞凋亡参与了胃癌的发病。

我们将在后续研究中通过建立胃癌动物模型，进一步深入探索URI在胃癌发病中的作用机制。