大花六道木叶片直接诱导不定芽再生研究

李水根，关 媛，李记开，刘秀云，李秀芬，朱建军*

(1上海市农业科学院林木果树研究所，上海，201403；2上海农林职业技术学院，上海，201600)

六道木为忍冬科(Caprifoliaceae)六道木属(Abelia)灌木，由于树干生长时有六道凹槽，加工成珠子后具有六道白边，故名六道木[1]。大花六道木(Abeliagrandiflora)是六道木中较早出现的园艺种，为半常绿矮化灌木，由中国的糯米条(A.chinensis)和单花六道木(A.uniflora)杂交而成，后经国外育种，形成了一些更有特色的园艺品种[2]，目前国内已有引进，但数量非常有限。大花六道木生长快，枝条柔顺下垂，树姿婆娑，株型非常美丽[2-3]。每年从初夏至仲秋都是大花六道木的盛花期，花量大且花期长，开花时节满树白花，晶莹剔透，衬以粉红的花萼、墨绿的叶片，分外醒目[4]。即使白花凋谢，红色的花萼还可宿存至冬季，连片种植时极为壮观。大花六道木根系发达，对土壤和肥力的要求不高，耐干旱、贫瘠和盐碱，萌蘖力、萌芽力很强，同时可反复修剪。大花六道木园林用途广泛，适宜丛植、片植于空旷地块、水边或建筑物旁。既可修成规则球状列植于道路两旁，或做花篱，也可自然栽种于岩石缝中、林中树下[5]。华东、西南及华北可露地栽培，是庭院绿化观赏和园林绿化设计的优良树种[6]。

虽然大花六道木的品种繁多，观赏效果极佳，但由于其种子小，不易收获，部分观赏品种几乎不结种子，只能通过扦插繁殖[7]，繁殖时需要大量的母株插条，繁殖系数低且费时费力。目前，国内外对六道木组织培养的研究较少，根据已有文献报道，以前的组织培养方法均是通过培养具有生长点的茎段直接诱导器官发生的方式获得无菌苗[8-10]，然后通过无菌短枝扦插或丛生芽的方式实现植株扩繁增殖，此方法增殖系数为每30 d增殖2.8倍左右[8]。大花六道木叶片诱导愈伤发生较容易，但愈伤难以分化成不定芽[9-10]。在生根培养时植株基部又容易产生愈伤组织，导致生根困难。本试验主要对大花六道木叶片不定芽诱导和生根培养进行研究，从而实现大花六道木的离体再生和规模化繁殖。

1 材料与方法

1.1 材料及外植体消毒

以上海市农业科学院奉浦院区苗圃栽培的大花六道木为试验材料，于2017年4月份采集刚展开的幼嫩叶片。于自来水水龙头流水下冲洗1—2h，转入超净工作台进行消毒，体积分数为75%的酒精浸泡1 min，质量分数为0.1%的升汞消毒5—10 min，消毒过程中不断摇晃使消毒液充分浸泡材料，然后用无菌蒸馏水冲洗至少5遍，用无菌吸水纸吸干多余的液体后备用。

1.2 不定芽诱导及丛生芽增殖

将消毒好的叶片剪成约1 cm2的小方块，叶片近轴面朝上接种于不定芽诱导培养基上，不定芽诱导培养基采用改良MS(MS大量元素减半)为基本培养基，同时添加不同浓度的细胞分裂素6-BA(6-苄基腺嘌呤)、KT(6-糠基氨基嘌呤)、生长素NAA(萘乙酸)、30gL蔗糖和2.8 gL结冷胶。将培养基于120 ℃，20 min条件下高温高压灭菌后分装于直径为9 cm的培养皿中。试验共设计5个处理：KT 0.4 mgL；6-BA 0.2 mgL；6-BA 0.4 mgL；6-BA 0.8 mgL；6-BA 0.4 mgL+NAA 0.05 mgL(表1)。每个处理包含6皿。在25 ℃、黑暗条件下培养，每隔1个星期观察1次。1个月后统计愈伤和不定芽诱导情况。诱导率=(愈伤或不定芽发生的数量/外植体数量)×100%。

表1 不同激素处理对大花六道木不定芽诱导的影响

增殖培养基组分参考汪思奇等[8]的研究。将培养基分装于瓶中，每瓶装入约50 mL培养基。然后置于高温高压灭菌锅中，在120 ℃、20 min条件下灭菌后冷却备用。将不定芽从外植体上切下，转接于增殖培养基，置于25 ℃，光照强度2 000—3 000 lx、光照周期16 h8 h(白黑)条件下，培养并形成丛生芽。

1.3 不定芽生根

待增殖培养基中生长的不定芽长度大于1 cm时，将其转接于生根培养基上。生根培养基组分采用L9(34)正交试验表进行设计，包括4个试验因子(基本培养基、IBA、NAA、蔗糖)，每个因子包含3个水平(表2)，每个处理设置3次重复，每瓶接种10个不定芽，培养条件与增殖培养相同。培养1个月后统计生根率，取平均值。生根率=(生根的植株数量/接种的植株数量)×100%。

表2 L9(34)生根培养基正交试验设计

1.4 数据分析和图像处理

采用DPS软件进行正交试验设计和统计分析，方差分析采用Duncan多重比较，显著水平为P<0.05。图片处理采用Adobe photoshop CS3和Adobe illustrator CS5。

2 结果与分析

2.1 不定芽诱导培养基的筛选

将大花六道木叶片剪成小方块接种于诱导培养基，在培养约15 d后叶片出现弯曲，拱起或上翘，叶片伤口处开始膨大。随着培养时间的延长，部分叶片保持绿色，并在伤口处产生愈伤组织和不定芽，而其他叶片黄化，甚至褐化死亡(图1a)。

在含不同植物生长调节剂的培养基上，叶片的反应差异很大。不定芽和愈伤的诱导率统计结果见表1。其中，在改良MS培养基中添加6-BA 0.4 mgL和0.8 mgL的两个处理中，叶片周围均有不定芽发生，诱导率分别约为35%和18%。但是，当6-BA为0.4 mgL时，叶片周围只有不定芽发生，且几乎没有愈伤组织形成(图1b)。而在0.8 mgL的6-BA处理中，叶片周围既有不定芽发生，同时伴有愈伤组织产生，愈伤组织的诱导率达到46%左右。在同时添加0.4 mgL 6-BA和0.05 mgL NAA的处理中，没有不定芽发生，而愈伤组织的诱导率提高到66%左右。在分别添加0.4 mgL KT和0.2 mgL 6-BA的两种培养基上，叶片既没有愈伤组织发生，也没有不定芽形成。值得注意的是，随着培养时间的延长，所有处理条件下诱导的愈伤组织均逐渐褐化凋亡，为非胚性愈伤组织，没有再生能力。因此，添加6-BA 0.4 mgL的改良MS最适合于大花六道木叶片通过直接器官发生途径，诱导不定芽再生。

将不定芽从外植体上切下，转接于增殖培养基上，培养1个月左右，不定芽通过增殖形成丛生芽，每团丛生芽含有数十棵植株(图1c)，增殖效果明显。

a：外植体培养15d；b：不定芽直接发生；c：丛生芽增殖；d：组培苗生根；e：组培苗移栽驯化图1 大花六道木叶片诱导不定芽再生、增殖及生根过程Fig.1 The process of shoots induction，proliferation and rooting

2.2 大花六道木植株不定根发生的影响因子研究

以增殖后长度大于1 cm的不定芽为试验材料，进行诱导生根研究。基本培养基、IBA、NAA和蔗糖浓度对不定芽生根率影响见表3。就各因子对生根率的影响分别进行统计学分析，结果表明：在3种基本培养基之中，不定芽生根率最高的为WPM培养基和MS培养基，两者差异不显著。在不同浓度的IBA处理中，0.5 mgL和1.0 mgL 两个水平下，不定芽生根率差异不显著，但均显著高于未添加IBA的处理，考虑到节约成本，采用IBA 0.5 mgL的水平。在3个浓度的NAA处理中，1.0 mgL的NAA处理后的不定芽生根率显著高于其他两个浓度处理后的生根率。在含不同浓度蔗糖的培养基中，其中添加20gL蔗糖的培养基中不定芽生根率显著高于其他两个处理水平。正交方差分析(表4)表明，不同试验因子对大花六道木不定芽生根率的影响差异显著。对各因子的极值进行比较分析表明，基本培养基、IBA、NAA和蔗糖的极差大小分别0.2519、0.2878、0.301、0.5312，因此对大花六道木生根的影响因子的主次关系为蔗糖>NAA>IBA>基本培养基。根据各因子水平的大小，最后得到最优的生根培养基组分为WPM(或MS)+ IBA 0.5mgL+NAA 1.0 mgL+蔗糖 20gL。

表3 大花六道木诱导生根的正交试验方案与结果

表4 4个试验因子对大花六道木不定芽生根率的正交试验统计学分析

注：同行中不同小写字母表示在0.05水平上差异显著

对优化的培养基进行试验验证，结果得到生根良好的大花六道木植株(图1d)，生根率达到90%以上。将根系发育良好的组培苗移栽到温室进行驯化，采用草炭∶珍珠岩=4∶1的栽培基质，移栽成活率在95%以上(图1e)。

3 讨论

3.1 6-BA促进大花六道木不定芽再生

植物离体再生的关键步骤是植物已分化的体细胞实现脱分化，获得干细胞功能[11]这一过程。此过程一般诱导形成具有再生能力的愈伤组织，或不经过愈伤组织而直接实现器官发生。本试验通过直接器官发生的方式，诱导大花六道木的叶片发生不定芽，虽然伴随少量愈伤组织形成，但不需要单独诱导愈伤组织进行器官分化，可以减少再生过程中遗传变异的概率。在脱分化的过程中生长素和细胞分裂素发挥重要作用。试验发现，添加低浓度6-BA的改良MS培养基最适合诱导不定芽，实现大花六道木的不定芽再生，可应用于遗传转化的受体系统。与采用茎段繁殖相比，叶片作为外植体诱导不定芽发生，可以显著提高大花六道木的增殖效率。当6-BA的浓度增大时，不定芽的诱导率有所降低，同时诱导愈伤组织发生。孙倩婷[9]和吕朝萍[10]利用大花六道木的叶片和茎段培养诱导愈伤组织发生，但是愈伤只能分化产生大量根状物，无法诱导不定芽或体细胞胚再生。本试验中诱导形成的愈伤组织同样没有再生能力，无法诱导不定芽再生。近年来研究表明，多能愈伤的细胞学属性类似于根源基细胞[12]，并非所有的植物体细胞都能被诱导产生愈伤组织,它只来源于特定类型的再生潜能细胞[13]。因此，采用合适的外植体是诱导愈伤发生的关键，关于大花六道木多能愈伤的诱导和分化需进一步探索研究。

6-BA和KT都是人工合成的细胞分裂素，本研究发现6-BA在诱导六道木器官再生中的效果优于KT，在添加KT的培养基上无法实现大花六道木的叶片进行脱分化。在植物组织培养中，一般需要生长素和细胞分裂素配合使用，才能诱导植株再生。而本试验在诱导培养基中添加6-BA 的同时，加入低浓度的生长素NAA后，不定芽的诱导反而受到抑制，并促进愈伤组织的形成，表明NAA抑制大花六道木直接不定芽再生。

3.2 大花六道木生根的影响因子

将不定芽从增殖培养基转到生根培养基时，由于细胞分裂素的残留效果，阻碍了不定根原基的发生，因此必须提高外源生长素和细胞分裂素的比例，在生根培养基中添加一定浓度的生长素是诱导生根的重要因素。从试验结果来看，没有添加任何激素的培养基上生根率只有约10%，同时添加生长素IBA和NAA可有效促进大花六道木生根。本研究发现蔗糖对生根的影响较大，蔗糖的作用除了为植物生长提供碳源外，还起到调节培养基渗透压的作用[14]，适当降低蔗糖的浓度有利于大花六道木不定根的发生。

致谢:上海市延安中学的朱心毅同学在试验材料培养和数据统计方面参与了部分工作，在此表示感谢。