脱氢表雄酮对血管性痴呆小鼠学习和记忆能力的改善作用*

李 静， 白 玉， 张 鹏， 丁 瑞， 赵学梅

(齐齐哈尔医学院 1药学院， 2临床药理教研室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指由于脑血管疾病所导致的脑实质损伤而引起智能和认知功能障碍的临床综合症[1]。VD是我国老年痴呆的第二大致病因素，仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)，已成为损害中老年人健康和生活质量的常见病、多发病。血管性痴呆可导致空间认知和学习记忆障碍。随着我国人口老龄化的不断发展及脑血管疾病(例如中风)发病率的逐年上升，血管性痴呆可能成为引起老年痴呆的首位原因。

脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是主要由肾上腺合成和分泌的一种性激素的前体物质。DHEA也可在神经元与星形胶质细胞中从头合成，它是中枢神经系统中含量最丰富、活性最强的一种神经甾体激素。DHEA可以通过多种不同机制发挥神经保护、神经调节和神经营养的作用，能够延缓衰老，还能改善情绪。人体内DHEA浓度于20岁左右达到峰值，然后逐年递减，而DHEA浓度下降可能导致老年痴呆等老年病的发生。DHEA对老年痴呆疾病作用的研究多集中在对AD的研究。实验研究表明，DHEA可以改善Aβ痴呆大鼠的学习记忆功能，DHEA浓度降低与AD的发病率和Aβ在脑内的沉积量正相关[2]。但是目前尚未查阅到DHEA对血管性痴呆的认知及记忆能力影响的相关报道。本研究采用双侧颈总动脉结扎(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)缺血再灌注的方法，制作小鼠血管性痴呆模型，通过Y迷宫和新物体辨别行为学观察及Western blot法检测小鼠海马组织神经元核抗原(neuronal nuclear antigen, NeuN)、突触小泡蛋白(synaptophysin,SYP)和突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein-95, PSD-95)的含量，研究DHEA对血管性痴呆小鼠学习和记忆的作用，并探讨其可能机制。

材 料 和 方 法

1 动物

健康昆明小鼠40只，雄雌各半，体重18～22 g，购自哈尔滨医科大学，动物许可证号为SYXK(黑)2016-001。

2 实验试剂

DHEA购自Sigma；抗PSD-95抗体、抗SYP抗体和抗NeuN抗体购自Proteintech；BCA蛋白浓度测定试剂盒和I抗、II抗去除液购自碧云天生物技术研究所； II抗购自北京中杉金桥生物技术公司。

3 主要方法

3.1动物分组 实验开始前动物适应性喂养1周，采用BCCAO法构建小鼠VD模型。将小鼠随机分为5组：假手术(sham)组、模型(BCCAO)组、DHEA低剂量组(DEHA-low,20 mg/kg)、DHEA中剂量组(DHEA-middle,40 mg/kg)和DHEA高剂量组(DHEA-high,60 mg/kg)，每组8只小鼠。

3.2动物模型建立 将小鼠用戊巴比妥钠(15 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定于鼠板，充分暴露颈部皮肤，常规消毒。除假手术组外，每只小鼠均进行双侧颈总动脉结扎15 min后再灌注。假手术组小鼠仅分离迷走神经，不结扎颈总动脉[3]。

3.3给药方法[4]DHEA用DMSO溶解后，再用植物油将其稀释成终浓度为0.1%的DMSO。低、中、高剂量组小鼠在缺血再灌注后24 h给予DHEA一次性腹腔注射。假手术组和模型组小鼠腹腔注射等体积的植物油。

3.4Y迷宫实验[5]小鼠Y迷宫实验装置由呈现Y字型的3个支臂组成，分别为A、B和C臂，每个支臂长40 cm,高12 cm,底部宽5 cm,顶部宽10 cm。实验时将小鼠放入固定某臂的末端，容许其自由进出3个臂。在5 min内，记录小鼠进臂总次数 N及进臂顺序。小鼠连续进入3个不同的臂被定义为1次正确交替反应，记录正确交替反应次数(number of alternation)，用自发交替反应率(alternation beha-vior)反映小鼠空间工作记忆能力。计算公式为alternation behavior=number of alternation/(N-2)。

3.5新物体辨别实验[5]实验装置是一个正方形盒子(长45 cm，宽45 cm，高15 cm)。测试前2 d，将小鼠放入实验场地中适应环境5 min，每次1只，每日2次。测试当日，将小鼠放入实验场地内允许其自由探索3 min，然后取出，再将2个相同的物体(A1、A2)分别放置于距场地边缘15 cm处，2者间隔15 cm。将小鼠与两物体等距离处面向壁放入场地中，分别记录5 min内探索两物体的时间(tA1和tA2)。1 h后，将A2换成新物体B，将小鼠再次放入，分别记录5 min内探索两物体的时间(tA1和tB)。24 h后，将物体B换成新物体C，将小鼠再次放入，分别记录5 min内探索两物体的时间(tA1和tC)。分别计算对新物体的优先指数及辨别系数。优先指数计算公式为： preferential index (1 h)=tB/(tA1+tB)； preferential index (24 h)=tC/(tA1+tC)。辨别系数计算公式为：discrimination index (1 h)=(tB-tA1)/(tA1+tB)； discrimination index (24 h)=(tC-tA1)/(tA1+tC) 。

3.6Western blot检测相关蛋白表达 将小鼠断头处死，置于冰盘中，暴露脑组织，用生理盐水冲洗表面血迹，快速分离出海马组织，-80 ℃保存。提取假手术组、模型组和DHEA中剂量组(行为学治疗效果最为显著)蛋白，蛋白定量后，加入上样缓冲液，煮沸 5 min，分装。用10%聚丙烯酰胺分离胶，4% 聚丙烯酰胺浓缩胶进行电泳，将蛋白质从 SDS-PAGE 凝胶转移至PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉封闭，加 I 抗，4 ℃孵育过夜，加 II 抗，室温孵育2 h，显影。用IPP软件分析目的蛋白条带的积分吸光度(integral absorbance，IA)，计算目的蛋白的相对表达量。

4 统计学处理

数据用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料测定值采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组之间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学差异。

结 果

1 DHEA对痴呆小鼠Y迷宫实验的影响

实验显示各组小鼠进臂总次数的差异无统计学显著性，提示DHEA对动物大脑皮层无兴奋性影响，见图1A。与假手术组的小鼠相比，模型组小鼠自发交替反应率显著降低(P<0.01)；DHEA治疗组可以显著提高小鼠自发交替反应率(P<0.05)，提示DHEA能够显著提高小鼠空间记忆能力，见图1B。

Figure 1.Effects of DHEA on the number of arm entries (A) and alternation behavior (B) of the mice in Y-maze test. Mean±SD.n=8.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsBCCAO group.

图1DHEA对Y迷宫实验中小鼠进臂总次数和自发交替反应率的影响

2 DHEA对痴呆小鼠新物体辨别实验影响

实验结果显示，模型组小鼠的优先指数和辨别系数均显著低于模型组小鼠(P<0.01);与模型组相比，DHEA组显著提高小鼠在新物体辨别实验中的优先指数和辨别系数，提示DHEA组小鼠对新物体辨别的记忆能力要强于模型组小鼠(P<0.01),见表1。

表1 DHEA对小鼠探索新物体能力的影响

##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsBCCAO group.

3 DHEA对血管性痴呆小鼠海马组织NeuN、SYP和PSD-95蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与假手术组相比，模型组的NeuN、SYP和PSD-95蛋白表达显著降低(P<0.05)；与模型组相比，DHEA组的NeuN、SYP和PSD-95蛋白表达显著升高(P<0.05)，提示DHEA能显著减少缺血导致神经元的死亡，提高海马突触相关蛋白的表达，说明DHEA可以减少神经元的丢失，改善突触的功能，见图2。

Figure 2.Effects of DHEA on the protein expression of NeuN, PSD-95 and SYP in the hippocampus. Mean±SD.n=5.#P<0.05vssham group;*P<0.05vsBCCAO group.

图2DHEA对海马NeuN、PSD-95和SYP蛋白表达的作用

讨 论

随着我国老龄化速度的进一步加快，血管性痴呆已成为老年痴呆的第二大致病因素。血管性痴呆是发生在脑血管病基础之上，以记忆、认知功能缺损为主，或伴有语言、视空间技能及人格或情感障碍的获得性智能的损害。多数学者认为，血管性痴呆可导致空间作业和认知能力下降，表现出分辨的准确性降低，出现明显的学习记忆障碍[6]。血管性痴呆已经成为严重威胁人类健康甚至是生命的重要疾病之一，虽然广受关注，但是目前国内外尚无可以控制该病病程进展的理想药物。

DHEA是一种可在神经系统中独立合成的神经甾体物质，它在脑组织的含量高于其它组织，且脑中DHEA含量不受血清DHEA含量影响。DHEA具有多种作用，可改善情绪、认知、记忆功能，具有防治神经退行性疾病及精神疾病的前景。本实验采用双侧颈总动脉结扎缺血再放开的方法，致小鼠全脑缺血再灌注损伤，构建小鼠血管性痴呆模型。通过行为学实验及Western blot实验考察DHEA对血管性痴呆小鼠学习和记忆能力的改善作用及可能机制。

行为学实验的种类不同，其考查学习记忆的种类也不同。Y迷宫实验考查动物的工作记忆能力，而新物体辨别实验则考察动物的行为辨别及记忆能力。通过Y迷宫实验研究发现，模型组小鼠与假手术组相比，进臂错误次数显著增加，DHEA能够显著减少血管性痴呆小鼠在Y迷宫实验中的错误反应次数，显著增加自发交替反应率。新物体辨别实验研究发现，与假手术组相比，模型组小鼠的辨别系数和优先指数显著降低，DHEA显著提高痴呆小鼠对新物体的辨别能力。以上结果均提示DHEA能够改善血管痴呆模型小鼠的空间认知、行为辨别及记忆能力。

神经元损伤与死亡[7]，突触的改变[8]是血管性痴呆发病的重要机制。有研究发现，脑缺血再灌注后，可引起海马神经元损伤及数量减少、残存神经元突触结构被破坏，进而引起突触功能障碍[9]。NeuN被称为神经细胞特异抗原的标志物，常作为检测神经元的指标。通过Western blot对小鼠海马区NeuN蛋白的表达水平进行检测，结果发现与模型组相比，DHEA组小鼠NeuN的表达水平显著增高。实验结果提示DHEA具有减少海马神经元丢失的作用。

突触是神经元网络联系和信息传递者，是学习记忆形成的基础，对代谢紊乱、能量缺乏高度敏感，脑缺血会造成突触相关蛋白的丢失[10-11]。脑缺血-再灌注损伤导致的突触传递障碍可能是导致血管性痴呆学习记忆障碍的重要机制之一。海马是与学习记忆密切相关的部位，但同时也是最易受缺血因素影响的脑区之一。SYP是一种与突触结构和功能相关的囊泡膜上的特异性钙结合蛋白。SYP存在于突触前的囊泡上，常把它作为突触前的特异性标志物。SYP在突触囊泡的导入、转运和神经递质的释放过程中均发挥重要作用，而且参与突触囊泡的再循环和突触发生。突触素减少，说明突触囊泡的转运能力降低，传递性能下降[12]。研究发现，认知功能下降的抑郁症小鼠其SYP在mRNA和蛋白水平表达下调，突触重塑受到破坏[13]。PSD-95是突触活性区突触后膜下方与胞浆相连的致密物质，而其中的PSD-95也称作突触相关蛋白90(synapse-associated protein 90，SAP-90)，是在谷氨酸能突触后致密区的一类特殊蛋白质，具有维持突触正常结构及突触可塑性的作用，从而保证突触信号正常传递[14-15]。PSD-95可介导逆行性信号传递，增加突触前膜突触素的表达，提高阿尔茨海默病大鼠的空间学习记忆能力[15]。通过Western blot实验检测血管性痴呆小鼠受损海马的SYP和PSD-95表达，探讨DHEA调控血管性痴呆小鼠学习记忆的机制。实验结果发现，血管性痴呆小鼠海马的SYP和PSD-95蛋白表达水平显著下降，DHEA组可显著提高SYP和PSD-95蛋白表达水平的表达。结果提示DHEA可能是通过调节海马SYP和PSD-9的表达，发挥调节突触功能，减轻血管性痴呆小鼠突触损伤的作用。

综上所述，本实验研究发现DHEA具有改善血管性痴呆小鼠的学习和空间记忆障碍的作用，而且上调NeuN、SYP和PSD-95的蛋白表达。提示其作用机制可能与减少神经元的丢失，降低神经元的突触损伤，调节突触功能有关。

为了进一步研究DHEA对血管性痴呆小鼠的学习与记忆能力的影响，探讨其作用机制，下一步将从以下3个方面进行实验研究：(1)进行形态学实验(例如尼氏染色、免疫组化、电镜等)，验证DHEA减少神经元丢失和改善突触可塑性的作用；同时可通过电镜观察细胞的形态和超微结构，从形态学观察DHEA抑制VD小鼠海马神经元的丢失作用是否与其调节凋亡和自噬有关。(2)采用Western blot及免疫组化方法，考察DHEA能否具有调控VD小鼠海马神经元的凋亡相关蛋白(Bcl-2和cleaved caspase-3)和自噬的相关蛋白(beclin-1和LC3)表达的作用。(3)使用sigma-1R KO小鼠和sigma-1R的激动剂及拮抗剂，研究其作用是否与激动sigma-1R有关，并且研究其作用与神经营养因子之间的关系。我们将通过这些实验探究DHEA在血管性痴呆中的价值，为开发新的治疗血管性痴呆药物提供新的思路及理论基础。