嗜水气单胞菌灭活疫苗制备及其血清凝集抗体检测

■ 陈昌福 曹丽敏 陈 辉 方苹

（1 华中农业大学 武汉 430070；2 沈阳元丰饲料有限公司 沈阳辽中 110202；3 江苏省渔业技术推广中心 南京 210029）

从辽宁省沈阳市辽中区及其周边患细菌性败血症的草鱼（Ctenopharyngodon idellus）体内分离到嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的大量致病菌株中，选取毒力较强的菌株，制备成福尔马林灭活菌苗后，接种健康草鱼并收集其免疫血清。用血凝板法测定了免疫血清中对各分离菌株的凝集抗体效价，比较分析了分离菌株之间的抗原性（antigenicity）差异。结果表明，用6个菌株制备的灭活菌苗接种草鱼后，均可以诱导受免草鱼的血清中产生较高的凝集抗体效价，说明制备的灭活菌苗具有比较高的抗原性；免疫血清与各个分离菌株制备的灭活菌苗反应，出现的凝集效价高达512～2,048之间，说明用不同菌株制备的灭活菌苗上，存在能诱导草鱼产生凝集抗体的大量共同抗原。

我国发展水产养殖业的地域辽阔，在不同地方的同种致病病原生物是可能存在不同血清型的。如果将从某一个地方分离的某种致病病原生物制备的疫苗，应用到全国所有水产养殖区域时，就有可能由于致病病原生物血型抗原等的不同，导致实施免疫接种后的动物因为不能获得特异性免疫防御能力而导致免疫失败。因此，在我国选择某种致病病原生物的一个毒株制备成某种灭活疫苗，在全国范围内应用是难以取得一致良好免疫效果的，而是有必要根据各地致病病原生物的血清型等抗原性特点，制备适合在当地使用的所谓“自家疫苗（autogenous vaccine）”。

我们已经从辽宁省沈阳市辽中区及其周边养殖草鱼（Ctenopharyngodon idellus）体内，分离到对草鱼具有致病性的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）多株。为了研制预防有这种致病菌引起草鱼细菌性败血症，本研究从大量分离菌株中选取毒力较强的菌株，制备成福尔马林灭活菌苗后，接种健康草鱼并收集免疫血清，通过血凝板测定各分离菌株的凝集抗体效价，比较研究了分离菌株的抗原性（antigenicity）差异。现将结果报告如下：

1 材料与方法

1.1 致病菌培养

将从患病草鱼体内分离的A.hydrophila，并且通过人工感染毒力试验证明对健康草鱼具有较强毒力的LCG180626（1）、LCS180626（2）、LCP180626（3）、LCS180626（5）、LCG180626（6）和LCS180626（7）等6个菌株[3]，分别将其接种在BHIA（Diffco）培养基中，置于25℃恒温培养箱中培养48 h，以灭菌生理盐水洗下菌落并以3,500r/min离心，再用灭菌生理盐水清洗3次后集菌，采用灭菌生理盐水将菌液浓度稀释至107cells/mL后，作为接种草鱼的免疫原（immunogen）和进行免疫血清凝集效价测定的反应原（reactogen）。

而将LCG180501（1）、LCS180501（2）、LCP180501（3）、LCP180510（3）、LCG180510（4）、XCG180524（1）、LCP180616（1）、LCG180616（1）、LCG180618（1）、LCP180618（1）、LCS180618（1）、XCP180625（1）、XCG180625（1）、LCS180626（1）、LCG180626（3）、LCG180626（5）、LCG180626（7）、LCP180701（1）、LCG180721（1）、LCP180721（1）、LCS180527（1）、LCG180527（1）、LCP180527（1）等23个菌株，经过上述同样的方法培养、灭活处理后，仅用作测定免疫血清中凝集效价的反应原。

1.2 免疫原的制备

在制备的A.hydrophila菌液中定量添加0.02%的福尔马林，放置与28.0℃恒温培养箱中，放置24h后进行灭活后，即为福尔马林灭活A.hydrophila菌液。取灭活后的菌液100.0µL，分别接种在培养皿中，置于28.0℃恒温培养箱中，放置24h后进行观察，培养皿中无菌落长出，即证明菌体已经被彻底灭活，可以作为A.hydrophila灭活菌苗（免疫原和反应原）使用。

1.3 免疫接种

对每尾平均体重100.0g的健康草鱼，经胸鳍基部注射0.25mL灭活A.hydrophila菌苗后，每个菌株的灭活菌苗接种20尾草鱼，将免疫接种后的草鱼放回水族中，采用经过曝气自来水充气饲养，每天分早、晚各投喂1次由沈阳元丰饲料有限公司生产的草鱼人工配合饲料。饲养期间，水族箱中的水温变化在24～30℃之间。

1.4 采血

自免疫接种灭活A.hydrophila菌苗后，将供试鱼在水族箱中饲养28d后，从每一个试验和对照组水族箱中随机捞取6尾草鱼，采用注射器刺穿尾动脉和切断腹主动脉的方法采血，采集的血液盛装在玻璃试管中，首先在室温下放置2.0h，待其血液凝固后将盛血液试管移放入4.0℃冰箱中过夜，让凝血块进一步收缩后，分离免疫血清。

表1 受免草鱼血清中凝集和交叉凝集抗体效价的变化

1.5 抗体效价的测定

免疫血清中凝集效价的测定采用血凝板法进行。用于凝集反应的反应原除了用作本研究中免疫原的A.hydrophila的6个菌株的灭活菌苗外，还有从患病草鱼中分离的A.hydrophila，并经过福尔马林灭活的另外23个菌株制备的灭活菌体。

2 结果

健康草鱼在免疫接种6个菌株制备的福尔马林灭活A.hydrophila疫苗后，血清中凝集抗体效价的变化的测定结果见表1所示。由表1可以看出，每个菌株的灭活菌苗（免疫原）均可以诱导受免草鱼血清中产生较高的凝集抗体效价，这种结果说明A.hydrophila灭活菌苗具有比较高的抗原性。将A.hydrophila的6个菌株制备的免疫原，免疫接种草鱼产生的免疫血清，与各个菌株制备的反应原凝集反应后，对不同菌株的反应原呈现的凝集效价高达512～2,048之间，这种结果说明用不同菌株制备的灭活菌苗上，存在能诱导草鱼产生凝集抗体的大量共同抗原。尤其是LCS180626（2）、LCP180626（3）、LCS180626（5）和LCS180626（7）等4个菌株上，似乎与各个菌株均存在比较多的共同抗原。

3 讨论

在世界范围内，我国是水产养殖业发展大国。在养殖水生动物过程中，由各种细菌和病毒引起的暴发性疾病比较多见。为了预防各种疾病对水产养殖业造成的巨大损失，对养殖水生动物实施免疫预防，已经被证明是有效的途径之一[4]。

由于我国发展水产养殖业的地域辽阔，在不同地方的同种致病病原生物是可能存在不同血清型的。因此，采用从某一个地方分离的致病病原生物（种毒）开发的商品化鱼用疫苗，往往难以在全国不同养殖区域获得同样理想的免疫防御效果。因此，有必要根据各地致病病原生物的血清型等特点研制自家疫苗，以满足免疫防控养殖水生动物疾病的需求[1]。

渔用自家疫苗的制备菌株是来源于疫苗应用地发病鱼群，从当地发病鱼体内分离鉴定致病菌后，经大量培养致病菌株制备自家疫苗。因此，其抗原成分基本包括了引起当地鱼群疾病的病原，比较全面的抗原可能在一定程度上对接种鱼群产生全面多方诱导，达到预防和控制疾病的目的。能有效地避免因不同的地区有不同的血清型病原菌存在，而因为不同血清型之间的抗原交叉保护力较弱，因而难以获得一种覆盖所有血清型的灭活疫苗的问题。

在本研究中，用A.hydrophila的6个菌株制备的灭活菌苗接种草鱼后，证明每个菌株制备的灭活菌苗均可以诱导受免草鱼的血清中产生较高的凝集抗体效价，证明了灭活菌苗均具有比较强的抗原性。从受免草鱼获得的免疫血清与从辽宁省辽中养殖区域收集的多个菌株制备的灭活菌苗进行凝集反应，均出现比较高的凝集抗体效价，证明了用不同菌株制备的灭活菌苗上存在能诱导草鱼产生凝集抗体的大量共同抗原。在6个制备灭活疫苗的菌株中，除LCG180626（1）和LCG180626（6）等2个菌株外，接种LCS180626（2）、LCP180626（3）LCS180626（5）和LCS180626（7）等4个菌株后，获得的受免草鱼血清中，几乎对所有作为反应原的菌株灭活菌苗，均可以产生比较高的凝集抗体效价。这个结果预示着如果采用这些菌株作为自家疫苗的出发菌株，就可能使受免草鱼获得对细菌性败血症比较强的免疫保护力。（参考文献略）