胃癌患者循环中OCT4表达水平与临床病理特征及生存率的关联分析

田 浩， 高 峡， 王雪尧， 马 翾

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，据2015年全球肿瘤流行病学调查报告显示，2012年全球约有951 600新发胃癌病例和723 100死亡病例，其中东亚地区(尤其是中国、韩国和日本)的胃癌发病率最高[1-2]。近年来，随着早期诊断，个体化治疗以及护理工作等各方面的提高和发展，胃癌患者的疗效有所提高，但其预后仍然欠佳。因此，积极探索有效的肿瘤标记物，用来预测胃癌患者的预后，从而进行有效的治疗和延长生存时间是及其必要的。

肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)作为肿瘤细胞的家族成员之一，具有强大的自我更新、异质性以及分化等特性，与肿瘤的发生、发展、转移和复发密切相关[3-4]。干细胞重要转录因子之一的八聚体结合蛋白4(octamer-binding transcription factor 4, OCT4)已被视为CSC的生物标记物，参与多种癌症的发展，如肝癌、食管癌、卵巢癌等[5-7]。然而，关于循环中OCT4的表达水平在胃癌患者中的作用目前尚不明确。本研究旨在评估血浆OCT4 mRNA表达水平与胃癌患者临床病理特征及预后的关联。

1 对象与方法

1.1对象 连续纳入2010年4月-2011年4月行手术治疗的胃癌患者137例，男性75例，女性62例；年龄(65.67±11.56)岁(43～96岁)；肿瘤大小(3.15±1.24)cm(0.5～6.0 cm)；低、中、高病理分化的患者分别有20例(15%)、99例(72%)及18例(13%)；T1，T2，T3及T4期的患者分别有3例(2%)、13例(9%)、119例(87%)及2例(1%)；N0，N1，N2及N3期的患者分别有49例(36%)、31例(23%)、49例(36%)及8例(6%)；处于M0及M1期的患者分别有135例(99%)及2例(1%)；根据TNM分期，处于Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及Ⅳ期的患者分别有16例(12%)，60例(44%)，59例(43%)及2例(1%)；血浆中OCT4 mRNA表达水平的中位值为2.316(0.219～8.450)。

入组标准：(1)经过临床、影像和病理评估诊断为胃癌；(2)年龄>18岁；(3)术前未接收任何新辅助治疗。排除标准：(1)合并恶性血液疾病；(2)合并严重感染或肝肾功能不全；(3)合并或有其他实体肿瘤史；(4)认知功能障碍或研究者判断难以定期随访的患者。本研究获得医院伦理委员会批准，患者在入组前均签署了知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本获取和检测 术前抽取外周血4 mL，利用Trizol Reagent (RNAiso Blood: 9112, 日本TaKaRa公司)抽提总RNA，利用分光光度计检测RNA的浓度及纯度。采用PrimerScript Real-time reagent kit (日本TaKaRa公司)逆转录RNA，运用SYBR Premix Ex TaqTMII (日本TaKaRa公司)定量分析OCT4 mRNA的表达。

1.2.2信息搜集和随访 记录患者的基线期年龄、性别、病理分期、肿瘤大小、T分期、N分期、M分期以及TNM分期。病理分期分为：高、中和低分化，TNM分期参考第七版美国癌症联合委员会胃癌分期标准(AJCC)。T分期按照T1～T4分别赋值0～3；N分期按照N0～N3分别赋值0～3；M分期按照M0～M1分别赋值0～1；TNM分期按照Ⅰ～Ⅳ分别赋值0～3进行分析。所有患者术后前半年每月随访1次，之后每3～6月随访1次，中位随访时间51月，最后随访日期为2016年12月。患者总体生存期(overall survival, OS)是指手术到患者由于任何原因死亡或最后一次随访的时间。

2 结 果

2.1OCT4 mRNA的表达水平与胃癌患者临床病理特征的关联 血浆中OCT4 mRNA的表达水平与肿瘤大小(R=0.351,P<0.001)成正相关。血浆中OCT4 mRNA的表达水平与患者其他临床病理特征的关联见表1。

表1 OCT4 mRNA的表达水平与胃癌患者临床病理特征的关联

数据采用相关系数R，P值和N表示；采用Spearman检验进行关联分析.

2.2OCT4 mRNA的表达水平与DFS和OS的关联 根据循环中OCT4表达水平的中位值，将患者分为OCT4高表达和低表达患者。采用K-M曲线和Log-rank检验分析血浆OCT4 mRNA的表达与胃癌患者DFS和OS的关联。胃癌患者的DFS中位值和均值分别为48.0月(21.5～61.0月)和41.1月(3～79月)；OS中位值和均值分别为69.0月(27.5～75.0月)和51.8月(3～80月)(P=0.001)。血浆OCT4 mRNA高表达水平患者的DFS及OS均比低表达患者差(图1)。

2.3OCT4 mRNA的表达水平与DFS关联的分析 相对于血浆OCT4 mRNA低表达水平，其高表达水平在肿瘤大小>3 cm(P=0.006)、病理分期为高分化(P=0.019)、病理分期为中分化(P=0.016)及TNM分期为Ⅱ期的患者(P=0.09)中与更差的DFS相关(图2)。

2.4OCT4 mRNA的表达水平与OS关联的分析 血浆OCT4 mRNA高表达相比于低表达在肿瘤大小<3 cm(P=0.005)、肿瘤大小>3 cm(P<0.001)、病理分期为中分化(P<0.001)、TNM分期为Ⅱ期(P=0.001)及TNM分期为Ⅲ/Ⅳ期的患者(P=0.005)中与更差的OS相关(图3)。

2.5DFS的影响因素分析 单因素Cox风险回归模型显示，血浆OCT4 mRNA高表达水平(P=0.002)与患者较差的DFS有关。进一步采用多元Cox回归模型分析胃癌患者DFS的预测因素，结果显示，血浆OCT4 mRNA高表达水平(P=0.006)能独立预测患者较差的DFS。其他临床病理特征对DFS的预测作用详见表2。

DFS：无病生存期； OS总体生存期. A:DFS; B:OS.图1 OCT4 mRNA表达水平与DFS和OS的关联Fig 1 The correlation of OCT4 mRNA expression with DFS and OS

2.6OS的影响因素分析 单因素Cox风险回归模型分析血浆OCT4 mRNA表达水平以及临床病理特征分别对胃癌患者DFS的影响，结果显示，血浆OCT4 mRNA高表达水平(P<0.001)、低分化(P=0.001)、高的N分期(P=0.034)以及高的TNM分期(P=0.010)均与患者较差的OS有关。进一步采用多元Cox回归模型分析胃癌患者OS的预测因素，结果显示，血浆OCT4 mRNA高表达水平(P<0.001)能独立预测患者较差的OS。其他临床病理特征对OS的预测作用详见表3。

图2 OCT4 mRNA表达水平与DFS关联的亚组分析Fig 2 The correlation of OCT4 mRNA expression with DFS in subgroups

图3 OCT4 mRNA表达水平与OS关联的亚组分析Fig 3 The correlation of OCT4 mRNA expression with OS in subgroups

项 目单元Cox比例风险回归模型P值HR95% CI低高多元Cox比例风险回归模型P值HR95% CI低高OCT4 mRNA高表达0.0021.7951.2482.5810.006 1.764 1.179 2.640 年龄>60岁0.5870.9040.6301.2990.562 1.135 0.740 1.739 性别(男)0.5061.1290.7901.6140.839 0.956 0.618 1.478 肿瘤大小>3 cm0.3681.1810.8221.6960.572 1.133 0.735 1.744 病理分期(低分化)0.211 1.236 0.887 1.722 0.853 0.962 0.642 1.443 T分期(高)0.5101.1530.7541.7640.936 0.970 0.460 2.045 N分期(高)0.1411.1480.9551.3790.410 1.221 0.760 1.960 M分期(高)0.137 2.938 0.710 12.157 0.186 4.995 0.461 54.116 TNM分期(高)0.111 1.237 0.952 1.607 0.834 0.916 0.405 2.073

表3 OS的影响因素分析

3 讨 论

胃癌作为全球常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。由于邻近组织的侵袭和远处器官的转移，导致胃癌患者临床进展迅速以及预后较差[8]。因此，尽早发现预测胃癌患者预后的有效肿瘤标记物，对进行有效的治疗和延长生存时间均具有重要临床意义。

OCT4作为Pit-Oct-Unc (POU)结构区域的转录因子家族成员之一，在维持干细胞的自我更新、异质性以及分化等特性中扮演着重要的角色[9-10]。大量研究表明，上调的OCT4可通过调节微小RNA(mircoRNA, miR)-26b/核转运蛋白α2轴来促进卵巢肿瘤细胞的增殖和转移[7]；通过调节miR-125b/BRI1相关受体激酶1信号通路来刺激宫颈癌细胞增殖，抑制其凋亡[11]；通过调节磷酸酶基因和细胞黏合素来增加肺癌细胞的转移[12]；通过调节丝苏氨酸蛋白激酶信号通路来促进胰腺癌细胞的增殖和迁徙[10]。本研究发现，血浆OCT4 mRNA的表达水平与低分化以及肿瘤大小成正相关，与文献报道一致[13-15]。此外，比起血浆OCT4 mRNA低表达患者，高表达患者有较差的OS。这可能是因为OCT4的表达水平可通过调节多种信号通路和细胞因子，促进肿瘤细胞的增殖迁徙和抑制其凋亡，从而诱导肿瘤的发生和发展[7, 11-12]。

此外，一些研究还评估了OCT4与恶性肿瘤患者预后的关系，其中，肿瘤组织中OCT4的高表达水平可作为食管癌、口腔癌以及膀胱癌等患者预后的独立危险因素[16-18]。尽管上述研究以肿瘤组织OCT4的表达为主，然而相对于肿瘤组织样本，血液样本的易获得性及无创伤性使患者更易接受。因此，本研究分析了血浆OCT4 mRNA的表达水平对于胃癌患者的预后作用，结果显示，血浆OCT4 mRNA的高表达与胃癌患者较短的OS相关，且可独立预测其不好的预后，与文献报道一致[16-18]。原因可能是OCT4作为CSC的生物标记物，其高表达可直接反映大量的CSC以及CSC更强的干性，这些干性可增加癌症患者对放疗、化疗以及传统的系统治疗的耐药性，从而降低治疗效果，增加胃癌患者的复发率。因此OCT4与患者较差的预后相关[19-20]。此外，OCT4的表达水平可通过调节多种信号通路，如p38丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、Wnt/β-catenin信号通路以及丝苏氨酸蛋白激酶信号通路，来刺激肿瘤细胞的增殖和迁徙，从而促进肿瘤的发展和转移，增加癌症的复发率[10, 21-22]。

本研究尚有一些不足：(1)本研究主要纳入处于TNM Ⅰ～Ⅲ期的胃癌患者，Ⅳ期患者仅2例，因此，血浆OCT4 mRNA的表达水平在Ⅳ期胃癌患者的预后作用尚不明确；(2)本研究样本量相对较小，可能导致其统计效能降低，检测指标的95%CI增宽，有可能导致偏倚等。(3)本研究纳入患者时并未限制患者的分期，导致研究对象的代表性不够。

综上所述，血浆OCT4 mRNA的表达水平可作为新颖的可靠的生物标记物，用于评估胃癌患者的临床病理特征和预后情况。