香蕉低聚糖对鼠李糖乳杆菌增殖条件的优化

范媛媛,罗诗泳,郑 冰,苏雪群,王 娟

(1.顺德出入境检验检疫局综合技术服务中心,广东顺德 528303;2.华南理工大学食品学院,广东广州 510641)

低聚糖是指由3～10个单糖分子通过糖苷键聚合而成的糖类化合物,是一类重要的生物信息分子,有多方面的生物功能,如增强免疫力、促进益生菌增殖、改善肠道微生态环境、抗氧化、增加某些必需矿质元素的吸收等等[1-3]。在健康人体消化道中的500多种细菌中,鼠李糖乳杆菌是有益菌,是人类研究最广泛的益生菌之一。经研究发现,低聚糖与益生菌协同作用,可以更好的发挥二者在改善肠道微生态环境、预防和治疗腹泻及便秘等方面的生理功能[4-15]。

目前功能性低聚糖已成为生物技术方面研究亮点,而国内研究主要集中在壳低聚糖、果低聚糖、魔芋低聚糖及一些中药提取物中的低聚糖,针对香蕉中低聚糖的研究却相对匮乏,而香蕉低聚糖属于功能性低聚糖,不仅是双歧杆菌、乳酸菌等一些益生菌的增殖因子,而且它是替代蔗糖的新型功能性糖源[16-19]。目前，关于香蕉低聚糖、香蕉抗性淀粉、膳食纤维的润肠通便功能，已有相关报道[20-23]，但有关香蕉低聚糖对乳杆菌增殖效果的研究却较少。

本研究以香蕉低聚糖为碳源,以纯度大于95%的低聚果糖为阳性对照,探寻香蕉低聚糖是否对鼠李糖乳杆菌有增殖作用,以及鼠李糖乳杆菌的最佳增殖条件及增殖规律。可为微生态制剂的研制、微胶囊保健品的开发、以及集营养、保健、食疗于一体的功效食品的生产提供基础数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香蕉低聚糖 (低聚糖含量:79.28%)华南理工大学食品科学与工程学院实验室自制;鼠李糖乳杆菌(ATCC 7469) 美国菌种保藏中心;低聚果糖 (纯度>95%)广州菲博生物科技有限公司;MRS液体培养基(不含葡萄糖) 广东环凯微生物科技有限公司。

SANYO MIR-153多功能培养箱 日本三洋公司;ESCO CLASSⅡ Type A2生物安全柜 新加坡艺思高科技有限公司;Synbiosis Acolyte 菌落计数仪 英国Synbiosis公司。

1.2 实验方法

1.2.1 香蕉低聚糖的提取、纯化及含量测定 用超声波法提取香蕉低聚糖,粗提液经过凝胶柱层析纯化后,采用蒽酮-硫酸法测定低聚糖含量[24-26]。

1.2.2 基础培养基的配制 用不同质量的香蕉低聚糖代替MRS液体培养基中的葡萄糖,其成分为[9]:胰蛋白胨10.0 g,酵母膏5.0 g,牛肉膏10.0 g,磷酸二氢钾2.0 g,磷酸氢二钾2.0 g,柠檬酸2.0 g,乙酸钠5.0 g,硫酸镁(含七水)0.58 g,硫酸锰(含四水)0.25 g,吐温80 1.0 mL,香蕉低聚糖(2、4、6、8、10 g),蒸馏水1000 mL,pH调至一定范围内(5.0～7.5)。

1.2.3 菌悬液制备 无菌条件下,将标准菌株活化,即将鼠李糖乳杆菌的标准菌株划线接种于MRS平板,于36 ℃培养箱中培养48 h,从培养后的平板中挑取适量的菌落,接种于无菌生理盐水,搅拌均匀后,进行梯度稀释,再用无菌吸头吸取0.1 mL涂布于相应的MRS平板,于36 ℃培养48 h,然后计数[23-29]。根据计数结果,选取浓度在104～108CFU/mL的菌悬液备用。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 培养时间对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响 将不同质量浓度的香蕉低聚糖(2、4、6、8、10 g/L)和1 mL 4.1×106CFU/mL的菌悬液,分别加入10 mL pH为7.0的基础培养基中;将1 mL 4.1×106CFU/mL的菌悬液,加入10 mL基础培养基中,作为阴性对照组;将6 g/L的低聚果糖和1 mL 4.1×106CFU/mL的菌悬液,加入10 mL基础培养基中,作为阳性对照组。混匀,于(36±1) ℃厌氧培养48 h,培养期间,选取不同的时间点计数(12、24、28、32、36、40、44、48 h),每个时间点做三个平行,取平均值。

1.2.4.2 香蕉低聚糖的添加量对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响 在pH为7.0、接种量为1 mL 4.1×106CFU/mL的鼠李糖乳杆菌菌悬液的基础培养基中,添加浓度为2、4、6、8、10 g/L的香蕉低聚糖,培养36 h时后,分别测定鼠李糖乳杆菌的菌落数,取对数后与添加量作图,比较不同香蕉低聚糖添加量对鼠李糖乳杆菌增殖数量的差异,得出最佳低聚糖的添加量。

1.2.4.3 初始菌液浓度对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响 将1 mL不同浓度的鼠李糖乳杆菌菌悬液(104、105、106、107、108CFU/mL)和6 g/L 的香蕉低聚糖加入10 mL pH为7.0的基础培养基中,混匀,培养至36 h,分别测定不同浓度的菌悬液中鼠李糖乳杆菌的菌落数。每个浓度做三个平行,取平均值。可知鼠李糖乳杆菌菌落数最高时的初始菌液浓度。

1.2.4.4 基础培养基的初始pH对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响 将6 g/L的香蕉低聚糖和1 mL 4.1×106CFU/mL的菌悬液,分别加入10 mL pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的基础培养基中,混匀,于36 ℃培养培养36 h,分别测定不同pH 菌悬液中鼠李糖乳杆菌的数量。每个pH做三个平行,取平均值。可知此鼠李糖乳杆菌菌落数最高时的基础培养基初始pH。

1.2.5 Box-Behnken中心组合试验设计 按照Box-Behnken的中心组合试验设计原理,选择对鼠李糖乳杆菌增殖有影响的四个因素:培养时间(A)、低聚糖添加量(B)、初始菌液浓度(C)和pH(D),进行四因素三水平的响应面分析试验,每个处理测定3次,取平均值。实验设计的因素、水平见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 数据统计分析

利用统计分析软件Design Expert建立回归模型,确定鼠李糖乳杆菌最佳增殖数量的条件及各因素与响应值之间的真实关系,并对鼠李糖乳杆菌增殖规律的数学模型进行方差分析,以验证真实值与预测值之间及检验方程的有效性。建立各因素间的回归优化响应曲面图,并对各因素间的交互作用进行方差分析与优化,通过回归模型得出鼠李糖乳杆菌的最佳增殖条件。

2 结果与分析

2.1 培养时间对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响

由图1可看出，不同质量浓度的香蕉低聚糖(2、4、6、8、10 g/L)对鼠李糖乳杆菌的增殖作用是在培养36 h左右达到高峰,其中香蕉低聚糖的添加量为6 g/L时,鼠李糖乳杆菌的增殖数量最多,可达到109数量级。主要是因为在以香蕉低聚糖为唯一碳源时,培养前期碳源充足,而鼠李糖乳杆菌处于对数生长期,生长旺盛;随着培养时间的增加,及香蕉低聚糖的消耗,在培养36 h后，鼠李糖乳杆菌的生长进入稳定期,菌落数量基本不再增加。阴性对照组在48 h的培养期间内,菌落数变化无显著性差异(p>0.05);阳性对照组在培养28 h后,鼠李糖乳杆菌数量可达到108数量级。阳性对照组的菌数小于香蕉低聚糖添加量为6 g/L培养液中的菌数。说明香蕉低聚糖作为碳源，对鼠李糖乳杆菌的增殖作用更强。

图1 培养时间对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响Fig.1 Effect of culture time on the proliferation of Lactobacillus

2.2 低聚糖添加量对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响

由图2可知,不同浓度的香蕉低聚糖对鼠李糖乳杆菌的体外生长有不同程度的影响。当低聚糖的添加量为6 g/L时,鼠李糖乳杆菌的增殖数量最多,可达到109数量级;当低聚糖的添加量为10 g/L时,鼠李糖乳杆菌的增殖数量明显最低,说明高浓度的低聚糖对鼠李糖乳杆菌的生长有抑制作用。这可能是由于高浓度的低聚糖造成培养基的碳源量过高,鼠李糖乳杆菌在代谢发酵后产酸,使培养基偏酸,造成了高渗透压的环境,鼠李糖乳杆菌细胞脱水,从而抑制了生长[30-32]。由此说明,低聚糖作为鼠李糖乳杆菌的生长增殖因子，有一定的浓度作用范围,过高或过低都不适宜鼠李糖乳杆菌的生长。

图2 香蕉低聚糖的添加量对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响Fig.2 Effect of additive amount of banana oligosaccharide on the proliferation of Lactobacillus

2.3 初始菌液浓度对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响

由图3可知,乳杆菌的初始菌液的浓度为106CFU/mL时,鼠李糖乳杆菌的增殖效果最佳。当初始菌液浓度小于106CFU/mL时,鼠李糖乳杆菌的增殖程度较高,数量可达到108数量级;当初始菌液浓度大于106CFU/mL时,鼠李糖乳杆菌的数量虽然比较高,但其增殖程度比较低,这可能是由于培养基的营养物质和能量有限,菌液浓度过高时,菌体间会产生竞争性抑制,导致菌体数量的平衡或降低,从而使增殖程度较低。

图3 初始菌液浓度对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响Fig.3 Effect of concentration of bacteria suspensions on the proliferation of Lactobacillus

2.4 基础培养基的初始pH对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响

由图4可知,香蕉低聚糖的浓度为6 g/L、菌悬液的浓度为106CFU/mL时,对鼠李糖乳杆菌增殖效果最好的基础培养基pH为7.0。当pH小于5.5时,鼠李糖乳杆菌的增殖速度慢、数量少,可能是由于培养基的酸度过高,不利于鼠李糖乳杆菌的生长繁殖,而鼠李糖乳杆菌生长又会产生乳酸等酸性物质,导致增殖数量一直比较低[30-32]。

图4 基础培养基的初始pH对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响Fig.4 Effect of pH of basic medium on the proliferation of Lactobacillus

2.5 响应面试验结果与分析

2.5.1 响应面回归模型的建立与分析 响应面试验结果见表2,对表2数据进行回归分析,得二次多项式回归方程:

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Box-Behnken design and test results

Y=-184.64667+2.54067A+1.79767B+7.03733C+34.97867D+0.001562AB-0.023125AC-0.083750AD-0.018750BC-0.097500BD-0.21000CD-0.024656A2-0.10925B2-0.38325C2-2.20300D2

对鼠李糖乳杆菌增殖规律的数学模型进行方差分析,方差分析结果见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression equation

方差分析中模型p值<0.0001说明回归方程是极显著的(p<0.01),相关系数R2=0.9905，说明响应值的变化有99.05%来源于所选变量,即培养时间、低聚糖添加量、初始菌液浓度和基础培养基pH。失拟项不显著,说明模型合适,回归方程对实验拟合情况好,可以较好的描述各因素与响应值之间的真实关系,可以利用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。一次项中培养时间、初始菌液浓度和基础培养基pH的p值均小于0.001,说明这三个因素对结果的影响非常显著;而低聚糖添加量的p值为0.0133,小于0.05,说明其对结果的影响显著。四个因素二次项的p值均小于0.001,说明这四个因素的平方项对结果的影响非常显著。六个交互项中只有培养时间和基础培养基pH交互作用的p值小于0.001,对结果影响非常显著;培养时间和初始菌液浓度交互作用、低聚糖添加量和基础培养基pH交互作用的p值均小于0.05,说明其交互作用对结果影响显著;而培养时间和低聚糖添加量、低聚糖添加量和初始菌液浓度交互作用的p值均大于0.05,说明其交互作用对结果影响不显著。

2.5.2 响应面交互作用的分析与优化 各因素的交互作用对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响见图5～图10。

图5 培养时间与低聚糖添加量的交互作用对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响Fig.5 Effect of culture time and additive amount of banana oligosaccharide on the proliferation of Lactobacillus

图6 培养时间与初始菌液浓度的交互作用对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响Fig.6 Effect of culture time and concentration of bacteria suspensions on the proliferation of Lactobacillus

图7 培养时间与培养基的初始pH的交互作用对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响Fig.7 Effect of culture time and pH of basic medium on the proliferation of Lactobacillus

图8 低聚糖添加量与初始菌液浓度的交互作用对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响Fig.8 Effect of additive amount of banana oligosaccharide and concentration of bacteria suspensions on the proliferation of Lactobacillus

图9 低聚糖添加量与培养基的初始pH的交互作用对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响Fig.9 Effect of additive amount of banana oligosaccharide and pH of basic medium on the proliferation of Lactobacillus

图10 初始菌液浓度与培养基的初始pH的交互作用对鼠李糖乳杆菌增殖数量的影响Fig.10 Effect of concentration of bacteria suspensions and pH of basic medium on the proliferation of Lactobacillus

响应曲面坡度越陡峭,说明响应值对于该因素的改变越敏感,而曲面坡度越平滑,说明该因素的改变对响应值的影响也就越小[33]。由各因子间的回归优化响应曲面图和方差分析可知,培养时间(A)与低聚糖添加量(B)、低聚糖添加量(B)与初始菌液浓度(C)的交互作用对鼠李糖乳杆菌的增殖影响不显著;初始菌液浓度(C)与pH(D)、培养时间(A)与pH(D)的交互作用对鼠李糖乳杆菌的增殖影响均显著。

2.5.3 最佳增殖条件的验证 通过回归模型得出的鼠李糖乳杆菌最佳体外增殖条件为:培养时间为37.2 h,低聚糖添加量为6.01 g/L,初始菌液浓度的对数为6.34,即菌液浓度为2.2×106CFU/mL,pH为6.80。在此条件下模型的预测值为9.1899。考虑到实际操作,将最佳条件调整为:培养时间为37 h,低聚糖添加量为6.00 g/L,菌液浓度为2.2×106CFU/mL,pH为6.80。在此条件下,进行三次重复实验,实际测得的鼠李糖乳杆菌数量为1.5×109CFU/mL,取对数后得9.1706,与预测值的RSD值为0.149%,提示此模型和方法的可行性和有效性较好。

3 结论

方程与实际操作所确定的鼠李糖乳杆菌最佳体外增殖条件为:培养时间37 h,低聚糖添加量为6.00 g/L,菌液浓度为2.2×106CFU/mL,pH为6.80。在此条件下,进行三次重复实验,实际测得的鼠李糖乳杆菌数量为1.5×109CFU/mL,取对数后得9.1706,与预测值的RSD值为0.149%,提示此模型和方法的可行性和有效性较好,其本试验所得模型合适,回归方程对实验拟合度好,其最佳优化条件适合于鼠李糖乳杆菌的增殖。