基于气相色谱-质谱联用技术的平菇多糖治疗大鼠急性肝损伤的代谢组学研究

张 艳,李 卉,满成云,鲁 婧,于海威

(1.吉林化工学院,化学与制药工程学院,吉林吉林 132022;2.吉林化工学院研究生院,吉林吉林 132022)

急性肝损伤是一种源于病毒、药物、毒物等因素导致的急性肝功能障碍。肝损伤是临床上多种肝病(如肝纤维化、肝炎、肝硬化以及肝癌)共同的病理基础,严重或持续的损伤最终可导致肝功能衰竭[1-2]。目前对于急性肝损伤的治疗多以西药为主。虽然西药治疗急性肝损伤上取得了一些进展,但仍存在一些不良反应[3-4]。因此,开发天然可食用的植物有效成分为保肝药是治疗急性肝损伤的新策略。

传统天然药物在治疗急性肝损伤上有独特理论与方法,能够从整体作用角度调节人体的机能,然而由于天然药物成分复杂、作用靶点多样,致使其作用机制大多不明确,这在一定程度上限制了天然药物在治疗急性肝损伤中的应用[5]。代谢组学是一门新近发展起来的技术,它是通过考察生物体系受疾病扰动后其代谢产物的变化,研究生物体系代谢途径的一种技术。其整体性的特点与中医理论不谋而合,因此代谢组学可以为天然药物作用机制研究提供新方法[6]。

平菇(Pleurotusostreatus)又名侧耳、糙皮侧耳,为真菌门担子菌纲伞菌目口蘑科侧耳属平菇的子实体,是世界范围内广泛栽培的食用菌之一。根据文献报道,平菇具有多种药理活性,如抗肿瘤作用[7-8]、抗氧化作用[9-10]、增强免疫作用[11]、治疗阿尔茨海默病作用[12]、降糖降脂作用[13-14]等。多糖是平菇的主要活性成分之一。四氯化碳CCl4是一种肝脏毒性物质,进入肝细胞后经过细胞色素P450酶代谢激活,产生三氯甲基自由基(CCl3·)和过氧化三氯甲基自由基(OOCCl3·),这些自由基与肝细胞膜、内质网和线粒体上的磷脂分子发生共价结合,引发脂质过氧化反应损害肝细胞[15]。本文选用CCl4造大鼠急性肝损伤模型。

传统保肝药的药效研究仅进行ALT、AST及ALP等病理生理指标的检测,只能从宏观上证明药物的干预作用,无法全面系统地揭示药物的作用机制。代谢组学是研究生物体受到外界扰动后内源性代谢物的动态变化,可以从微观的角度揭示其调节生物体各个系统发挥药物疗效的作用机制。因此,本文借助高通量、高灵敏度、高分辨率的气相色谱-质谱(GC-MS)联用分析手段,利用代谢组学和化学计量学的原理及分析软件对质谱数据处理、分析[16-18],考察生物体系病理条件下代谢物的变化及随时间的变化规律[19-21],筛选平菇多糖改善急性肝损伤的代谢物(标志物),从代谢变化的角度探寻平菇多糖治疗急性肝损伤的作用机制,为开发平菇多糖为保肝的功能性食品提供前期数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Wistar大鼠 雄性,体重180～220 g,许可证号:SCXK(吉)2016-0001 吉林大学白求恩医学院动物实验中心;N,O-双三甲硅基三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、脲酶、吡啶、癸酸 分析纯,上海麦克林公司;甲醇、CCl4北京化学试剂厂;花生油 市售(鲁花牌);谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒 深圳雷杜生命科学股份有限公司;平菇多糖 纯度45.44%,实验室自制。

Chemray 24型全自动生化分析仪 深圳雷杜生命科学股份有限公司;GCMS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪(配备EI离子源,AOC-20i自动进样器) 日本岛津公司;HP-5色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25μm) 美国Agilent公司;H2050R型低温高速冷冻离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 给药及造模 30只大鼠,适应性饲养一周后,随机分为3组:空白对照组、模型对照组、平菇多糖组。空白对照组和模型对照组分别按10 mL/kg给予水,平菇多糖组每天给予600 mg/kg的平菇多糖溶液,连续灌胃给药7 d,末次给药6 h后,除空白对照组给予生理盐水2 mL/kg腹腔注射外,模型对照组和平菇多糖组按2 mL/kg腹腔注射50% CCl4花生油一次(v/v),按照文献方法[15]改良建立急性肝损伤模型。造模后,收集24 h尿液,腹主动脉取血,4 ℃,3000 r/min,离心15 min,分离血清。

1.2.2 血清样品测试 各组大鼠血清稀释10倍,按试剂盒方法,全自动生化分析仪测试血清ALT、AST和ALP水平。

1.2.3 尿液前处理 尿样于12000 r/min离心10 min,取上清液100 μL于1.5 mL离心管中,加入50 μL脲酶水溶液(60 IU/100 μL),混匀后于37 ℃孵育30 min后，加入20 μL癸酸(0.088 g/L)和400 μL甲醇,涡旋混匀1 min,于12000 r/min,4 ℃离心15 min,吸取上清液400 μL于1.5 mL离心管中,真空干燥(4 ℃,10～300 Pa,24 h),后加入50 μL衍生化试剂(V(BSTFA)∶V(TMCS)=99∶1)和50 μL吡啶,于80 ℃水浴反应0.5 h,12000 r/min,4 ℃离心10 min,取上清液,用于GC-MS分析。

1.2.4 GC-MS测试条件 进样口温度:280 ℃;分流比:10∶1;载气:氦气;流速:1.88 mL/min;柱箱温度:60 ℃;柱温程序:起始温度60 ℃保持3 min后,以6 ℃/min升温到290 ℃保持10 min;进样量:0.2 μL,离子源和接口温度分别为200、230 ℃;电子能量:0.85 eV;溶剂延迟:5.5 min;全扫描模式,扫描范围m/z:35～600。

1.3 数据处理及分析

cdf格式的尿样原始数据经XCMS Online(https://xcmsonline.scripps.edu/index.php)软件得到总离子流(Total ion chromatography,TIC)图,进行峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等操作,将结果转化为包含化合物保留时间和质荷比信息的csv格式文件,并进一步采用Pairwise group分析和Meta group分析进行配对比较和组间比较,筛选可能的标志物。利用NIST(http://webbook.nist.gov/chemistry/)和HMDB(http://www.hmdb.ca/)数据库对筛选的标志物进行鉴定。采用MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)软件进行主成分分析(Principal components analysis,PCA)和代谢通路分析。

2 结果与分析

2.1 血清ALT、AST和ALP水平

如表1所示,与空白对照组比较,模型对照组大鼠血清中ALT和ALP活性显著升高(p<0.05),AST活性极显著升高(p<0.01);与模型对照组比较,平菇多糖组能显著抑制ALT、AST和ALP活性的升高(p<0.05)。ALT和AST是肝细胞内的两种酶,一旦肝细胞损伤,ALT和AST释放入血,血液中ALT和AST水平升高。血液中ALT和AST水平异常升高是肝损伤的典型标志[22]。本实验结果表明,经CCl4造模后,肝细胞膜已被破坏,表现为ALT和AST血清水平升高。经平菇多糖治疗后,ALT和AST血清水平有所降低。此外,肝细胞损伤同时可引起ALP水平的升高且与损伤程度呈正相关[24]。本研究结果表明,平菇多糖可明显降低ALT、AST及ALP水平,表明平菇多糖有明显的保肝作用,与文献报道的保肝药判断标准一致[22-24]。

表1 平菇多糖对急性肝损伤大鼠血清ALT、AST和ALP水平的影响Table 1 Effect of POP on ALT,AST and ALP in acute liver injury rats

2.2 各组尿液代谢轮廓分析

通过XCMS Online软件进行尿样的分离和数据采集,得到各组典型TIC图(图1)。图1所示,3组大鼠尿液代谢物有明显的差异。空白对照组和平菇多糖组的TIC图基本相似,色谱峰保留时间主要集中在8～35 min,但也有一定区别,而模型对照组色谱峰相对较少。由PCA图(图2)可以看出,空白对照组,模型对照组和平菇多糖组能够分开并且呈明显的聚类特征。空白对照组样本主要聚集在得分图的右侧,模型对照组样本主要聚集在得分图的左侧,给予平菇多糖治疗后,样本点的分布逐渐向模型组右侧移动,表明该组样本的代谢物有向空白对照组移动的趋势。

图1 各组大鼠尿液代谢物的总离子流图Fig.1 Total ion chromatography of urinary metabolites of three groups注:A：空白对照组;B：模型对照组;C：平菇多糖组。

图2 各组大鼠的PCA图Fig.2 Principal components analysis of three groups注:+NG:空白对照组,样本主要聚集在侧右;△MG:模型对照组,样本主要聚集在左侧;×PG:平菇多糖组,样本主要聚集中右侧,有向空白对照组移动的趋势。

2.3 标志物的鉴定

利用XCMS online软件的Pairwise group分析和Meta group分析筛选标志物,p值小于0.05且倍数变化大于2,可作为标记物的判断标准,根据它们分子量,利用NIST数据库和HMDB数据库对标志物进行质谱信息匹配,初步鉴定可能标志物。鉴定了5种化合物,分别为柠檬酸、苹果酸、D-葡萄糖醛酸、十六烷酸和1,2,3-丙烷酸。5种标志物的鉴定结果如表2所示，标志物在空白对照组、模型对照组和平菇多糖组代谢物谱中的相对含量有明显的差异。其中与空白对照组比较,模型对照组中柠檬酸、苹果酸、D-葡萄糖醛酸和1,2,3-丙烷酸含量下降,十六烷酸含量升高(p<0.05),而平菇多糖组中柠檬酸、苹果酸、D-葡萄糖醛酸和1,2,3-丙烷酸含量较模型组有显著升高,十六烷酸含量降低(p<0.05)。结果见表2。

表2 标志物的鉴定结果Table 2 Identification results of biomarkers

2.4 代谢通路分析

利用MetaboAnalyst 3.0软件对平菇多糖影响急性肝损伤大鼠的标志物进行代谢通路分析。结果如图3所示,主要影响3条通路,分别为三羧酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢。CCl4进入体内后,在肝细胞中积累并产生大量自由基,这些自由基与肝细胞中蛋白质,脂质结合最终导致细胞坏死和脂质过氧化等一系列反应,此外,产生的自由基还可直接攻击肝细胞,导致线粒体结构和功能异常[25]。线粒体是三羧酸循环的重要场所,因此,CCl4可直接导致能量代谢异常。柠檬酸和苹果酸属于三羧酸循环,平菇多糖可通过上调柠檬酸和苹果酸水平,改善三羧酸循环异常,缓解由于含氧自由基造成的线粒体损伤,维持线粒体的正常生理功能。乙醛酸和二羧酸代谢与体内的氧化反应有关,可通过影响三羧酸循环关键酶的活性，导致三羧酸循环中的各种反应物和产物水平异常[26]。CCl4刺激后的大鼠,大部分的行为活动都出现缓慢、疲乏、不活跃的现象,这可以认为是能量消耗进入一个相对缓慢过程。经CCl4刺激后,模型对照组大鼠出现了乙醛酸和二羧酸代谢通路相关的代谢异常。D-葡萄糖醛酸是乙醛酸和二羧酸代谢途径上的物质,平菇多糖通过升高D-葡萄糖醛酸水平,调节此代谢通路而发挥保肝作用。抗坏血酸和醛酸代谢也是和体内氧化反应有关的代谢,平菇多糖还可以通过调节抗坏血酸和醛酸代谢水平改善机体的氧化损伤,发挥保肝作用。

图3 平菇多糖影响大鼠的代谢通路分析Fig.3 Pathway analysis of Pleurotus ostreatus polysaccharide on rats

3 结论

平菇多糖有明显的保肝作用,可以显著降低大鼠急性肝损伤后血清ALT、AST和ALP水平(p<0.05),其治疗急性肝损伤的作用机制与扰动体内标志物柠檬酸、苹果酸、D-葡萄糖醛酸、十六烷酸及1,2,3-丙烷酸的水平,调节三羧酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢通路异常有关。平菇作为一种食品,从中提取多糖类成分,安全性高,将其开发为具有保肝活性的功能性食品具有实际应用价值。