芯片法和飞行时间质谱法在非综合征性耳聋基因筛查中的应用比较*

付华钰，李 娇，李 萌，许涓涓，黄萍丽，陈碧艳，杜 娟

(广西壮族自治区妇幼保健院，南宁 530003)

我国每年约出生2 000万个新生儿，据资料显示，约有1‰新生儿患先天性耳聋[1]，每年将新增约2万名听力障碍新生儿，其中60%与遗传因素有关[2-4]。韩明昱等[5]研究显示，我国常见耳聋基因携带率为5.3%。周怡等[1]对北京地区新生儿筛查，耳聋基因的携带率为3.6%。耳聋对患儿的认知、学习、交流能力有严重影响，在成长过程中的教育、治疗等费用支出巨大，给社会和家庭造成了严重的负担。因此，开展孕前和孕期夫妇耳聋基因筛查，并对高风险孕妇进行产前诊断、遗传咨询和医学干预，才是早期预防、减少耳聋患儿出生的有效措施之一。

非综合征性耳聋是指以耳聋为唯一症状的疾病，多为中重度、极重度感音神经性聋[6]。目前国内常见导致遗传性非综合征性耳聋的致病基因为GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12S rRNA等[7]。目前用于耳聋基因筛查的方法有很多种，如测序法、变性高效液相色谱分析、限制性片段长度多态性分析、限制性酶切指纹-单链构象多态性分析、芯片法以及飞行时间质谱法[8]。前3种方法成本高、操作复杂，不适于临床应用和大规模筛查。芯片法可检测中国人常见的4个耳聋致病基因的9个位点。飞行时间质谱法的全称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，该技术可检测常见的4个耳聋基因的20个位点。本研究旨在探讨芯片法和飞行时间质谱法在耳聋基因筛查中的作用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2014年5月至2015年4月在本院耳鼻喉科、儿科、遗传门诊就诊并自愿接受耳聋基因筛查的儿童、成人及胎儿，共710例。其中男371例，女335例，胎儿4例；年龄1～44岁，中位年龄21.6岁。

1.2方法

1.2.1标本采集 采集受检者外周静脉血4 mL、抽取胎儿羊水10 mL。

1.2.2提取DNA 将外周血和羊水离心后的沉淀细胞按照Qiangen公司DNA提取试剂盒说明书，经裂解、吸附、洗脱、溶解的步骤，提取标本DNA。并用紫外光分光光度计测定DNA溶液的浓度和纯度。

1.3基因检测

1.3.1芯片法 采用博奥生物工程有限公司的晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒(微阵列芯片法)进行检测。主要仪器、设备：聚合酶链反应(PCR)仪、晶芯BioMixerⅡ杂交仪、晶芯Slide Washer芯片洗干仪、晶芯LuxScan 10K-B芯片扫描仪和数据判别系统(博奥生物工程有限公司)。该微阵列芯片包含9个检测位点，具体位点见表1。根据试剂盒说明进行核酸扩增、杂交、洗片、扫描及信号读取。根据说明书进行结果判读。

表1 芯片法的检测位点

1.3.2飞行时间质谱法 与华大基因公司合作，借助其飞行时间质谱的技术和设备进行基因检测。仪器设备：Mass ARRAY DNA质谱阵列基因分析系统、ABI 3130XL测序仪、PCR仪、Mass ARRAY微量点样系统以及试剂盒。样本DNA进行提取、扩增、消化、延伸和纯化，产物质谱检测(详细步骤参照Sequenom Spectro CHIP Arrays操作说明书)，最后测序和数据分析。检测20个耳聋基因位点，具体位点见表2。

表2 飞行时间质谱法的检测位点

1.4统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计数资料以率或例数表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

710例研究对象中，芯片法检出异常37例，其中杂合突变25例，纯合/同质突变11例，235delC杂合突变复合1555A>G同质突变1例；飞行时间质谱法检出异常45例，其中杂合突变32例，纯合/同质突变11例，235delC杂合突变复合1555A>G同质突变1例和1229C>T与 1975G>C双重杂合突变1例。两种方法的检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、4。

表3 两种方法的检测结果(n)

续表3 两种方法的检测结果(n)

表4 两种方法的检出率比较

3 讨 论

中国人群中常见的非综合征性耳聋致病基因GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12S rRNA中，GJB2基因突变发生率最高，占26%～33%，其中主要为235delC、299delAT、176del16；SLC26A4基因常见突变为IVS7-2A>G，本研究的结果与文献[9-10]报道结果是一致的。本研究中应用芯片法和飞行时间质谱法进行耳聋基因筛查，芯片法的检测结果中，GJB2的检出率为3.24%，其次为SLC26A4，检出率为1.13%。飞行时间质谱法的GJB2的检出率与芯片法相同，SLC26A4基因突变的检出率略高，为2.11%。飞行时间质谱法包含的检测位点多，检出的基因携带者例数较芯片法高，但以上2种方法的检测结果，差异无统计学意义(P>0.05)。这两种方法均包含了以上常见基因及其位点，虽然飞行时间质谱法所含的基因位点更多，但芯片法的9个突变位点已经可以满足临床普通筛查的需要，这与统计学的结果：两种方法差异无统计学意义(P>0.05)是相符的。

耳聋基因筛查的目的是发现高危人群、预防疾病发生、降低出生缺陷。若儿童筛查的结果为基因纯合突变、双重杂合突变或线粒体同质突变，可进行相应的治疗改善其听力，或采取预防措施，避免患儿听力受损。对于双方均为基因携带者的夫妇，可进行相应的遗传风险咨询和婚育指导，必要时进行产前诊断，可避免耳聋患儿出生，以降低耳聋发生率。不同的基因发生突变，其导致耳聋的机制是不同的，预防和治疗的措施也是不同的。

GJB2位于染色体13q11-12，为常染色体隐性遗传，编码连接蛋白CX26,负责细胞间的信号传导，维持耳蜗内淋巴液高钾形成的正电位，保证细胞的正常功能。当GJB2基因发生突变后，编码连接蛋白CX26产量下降，直接影响K+进入淋巴系统循环，从而导致神经性耳聋[11]。GJB3位于1号染色体1p33-35，为常染色体隐性或显性遗传，编码缝隙连接蛋白CX31，该基因发生致病性突变可导致高频听力损失[6]。SLC26A4位于7号染色体7q22-31.1，常染色体隐性遗传，编码蛋白质Pendrin，SLC26A4基因致病性突变可导致Pendred综合征或大前庭导水管综合征。大前庭导水管综合征主要表现为迟发性语后聋。12S rRNA为中国人群中常见的线粒体耳聋致病基因[11]，为母系遗传，携带该基因的个体对氨基糖苷类抗菌药物具有高度的敏感性。致病突变在12S rRNA的A区形成一个新的结合碱基对,使12S rRNA的二级结构与细菌的16S rRNA更为相似，新结合碱基对促进了氨基糖苷类药物与线粒体12S rRNA相结合，抑制线粒体蛋白合成、使ATP产量下降，细胞内外离子浓度失衡，导致细胞损伤或凋亡[7]，使得携带该类突变的个体在使用氨基糖苷类药物后会发生听力缺失[11]。本研究主要通过对比线粒体12S rRNA、SLC26A4、GJB2、GJB3 4个基因致病位点的检出率，探讨芯片法和飞行时间质谱法在非综合征性耳聋基因筛查的优劣，为临床疾病筛查工作提供相关依据。

我国人口众多，耳聋基因的携带率和耳聋发病率均较高，因此开展耳聋基因筛查、降低耳聋发病率是一项长期而艰巨的任务。本研究中应用的两种筛查方法各有其优、缺点。芯片法包含了常见耳聋基因的9个突变位点，该方法所需的仪器设备少，成本低，操作和数据读取简单，适用于在临床工作中进行常规筛查。飞行时间质谱法涵盖了4个常见基因的20个位点，可检测范围广，检出率高，可以在一定程度上降低漏诊率，可应用于大规模人群的筛查和研究[12]。但该方法所需的仪器设备成本较高，且操作流程复杂，需要专业技术人员进行操作和读取数据，推广至一般的医疗机构有一定的困难。

随着人们优生优育意识的提高和医学的不断进步，耳聋基因筛查将会广泛地进行开展，各医疗或研究机构可根据自身的条件选择筛查的方法。总之，医务工作者的目标是通过耳聋基因筛查，做到早发现、早预防，早诊断、早治疗，尽可能地保护患儿听力，降低耳聋发病率及出生率。