人造血干细胞在不同温度下生长、凋亡的实验研究*

杨 鑫，周晓红

(重庆大学附属肿瘤医院/重庆市肿瘤研究所/重庆市肿瘤医院，重庆 400030)

人造血干细胞(HSCs)具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分(包括红细胞、白细胞和血小板)，HSCs也可以分化成其他细胞。有研究者在1961年通过“脾集落形成试验”，首先描述了HSCs的特性。威斯康星大学的THOMSON等[1]在1988年成功建立了胚胎干细胞系。在此之后，HSCs被进一步分化为神经细胞、造血细胞、肌肉细胞、胰岛细胞、心肌细胞、内皮细胞等[2-5]。HSCs良好的分化增殖能力对患者损伤组织的修复具有重要意义,使得干细胞能更加广泛地应用于临床。温度在细胞的培养条件中至关重要，有研究发现温度环境对细胞的生长和凋亡有影响[6-9]。目前关于温度影响HSCs生长和凋亡方面的报道较少。因此，本研究以温度作为干预条件，观察不同温度下体外培养HSCs的生长及凋亡情况，为进一步科研和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 上海拜沃生物科技有限公司提供HSCs。

1.2仪器与试剂 RPMI1640培养液(上海元龙生物技术有限公司)，IMDM培养基(GIBCO公司)，Metho CultTMHCC4230培养基(加拿大Stem cell Technologies Inc公司)，Annextin V(美国Becton,Dickinson and Company)，二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司)，LHC-250-Ⅰ恒温恒湿二氧化碳培养箱(北京陆希科技有限公司)，CKC-TR-2W型倒置显微镜(Olympus公司)，YJ-875型超净化工作台(苏州安泰净化设备厂)，6孔培养板(北中杉金桥生物技术有限公司)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京碧波生物科技有限公司)，BD-CAN7型流式细胞仪(美国 Becton,Dickinson and Company)。

1.3方法

1.3.1细胞培养 HSCs采用10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养。

1.3.2不同温度的细胞培养处理 将HSCs分成实验组和对照组。实验组细胞在恒温恒湿二氧化碳培养箱中培养的温度分别设定为33、35、39、41 ℃；对照组细胞在恒温恒湿二氧化碳培养箱中培养的温度设定为37 ℃。

1.3.3红系集落形成单位(CFU-E)集落培养 采用Metho CultTMHCC4230培养基，0.9 mL培养基加入0.1 mL的细胞悬液(细胞密度为每升2×109个)，用IMDM补充为1 mL，充分混匀后转移至35 mm的6孔培养板，每个标本重复5孔，置不同温度下培养，饱和湿度的培养箱内，培养4、7、10 d分别计数CFU-E集落，以含50个细胞以上的细胞团为1个集落。

1.3.4流式细胞仪检测HSCs凋亡率 采用10%胎牛血清的RPMI1640培养基，0.9 mL培养基加入0.1 mL的细胞悬液(细胞密度为每升2×109个)，用IMDM补充为1 mL，将HSCs在不同温度下分别培养6、12、24 h，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，通过流式细胞仪检测HSCs凋亡率。

1.3.5相关性分析 不同温度(33、35、37、39、41 ℃)下培养6、12、24 h，研究不同温度变化和流式细胞仪检测HSCs凋亡率的相关性分析。

2 结 果

2.1HSCs染色结果 经HE染色，细胞呈扁平状向外延伸生长，细胞核呈紫蓝色，细胞质和细胞外基质呈红色，见图1。

图1 HSCs染色结果(HE，×400)

2.2CFU-E集落分析结果 培养4 d，37 ℃组(对照组)CFU-E集落数最高，33 ℃组和35 ℃组与37 ℃组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；培养7 d，37 ℃组CFU-E集落数最高，33 ℃组、41 ℃组与37 ℃组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；培养10 d，37 ℃组CFU-E集落数最高，33 ℃组与37 ℃组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 CFU-E集落分析个)

注：与37 ℃组比较，*P<0.05

2.3流式细胞仪检测HSCs凋亡率 培养6 h，33 ℃组HSCs凋亡率最低，33 ℃组、35 ℃组与37 ℃组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；培养12 h，33 ℃组HSCs凋亡率最低，35 ℃组、39 ℃组与37 ℃组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；培养24 h，33 ℃组HSCs凋亡率最低，35 ℃组、41 ℃组与37 ℃组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 流式细胞仪检测HSCs凋亡率%)

注：与37 ℃组比较，*P<0.05

2.4相关性分析 分别培养6、12、40 h，在不同温度下流式细胞仪检测HSCs凋亡率：培养6 h后温度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率具有相关性(r=0.888,P<0.01)；培养12 h后温度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率具有相关性(r=0.795,P<0.01)；培养24 h后温度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率具有相关性(r=0.834,P<0.01)。

3 讨 论

HSCs在一定的温度条件下才能维持生命和代谢，根据细胞周围环境中温度的差异，其生物学行为也会随之表现不同。细胞在人体内生存的平均温度为37 ℃，因此目前细胞培养大多采用37 ℃作为标准温度。温度的变化对细胞的生长和凋亡存在一定的影响，温度的变化也促成了胚胎发育和多种病变的发展[10-14]。但目前对于HSCs的培养多采用常温环境，这与其在体内存在的具体环境存在一定的差异，因此采用不同温度培养HSCs可更加真实地模拟其体内外的生长环境。

作为前体细胞的HSCs最大的特点就是具有高度自我更新、自我修复和多向分化的能力。HSCs的复制、增殖、多向分化、归巢后重建造血、凋亡等生物功能受到周围各种环境因素的影响。HSCs主要生存于骨髓区、静脉血、动脉血中，37 ℃是其生存的平均温度，人体各个器官和组织的温度存在差异，在HSCs移植过程中温度也必然发生变化，温度的变化也将影响HSCs的各项生物学功能[15]。本研究中将各组温度设定为33、35、37、39、41 ℃，正是要观察HSCs在不同温度下的生长情况，而关于这方面的研究国内外报道较少。

本研究发现HSCs培养4、7、10 d，37 ℃组CFU-E集落数最高；HSCs培养6、12、24 h，33 ℃组HSCs凋亡率最低。由此推测，不同温度对HSCs的生长和凋亡有影响。37 ℃能促进HSCs的生长，温度降低可以抑制HSCs的凋亡,为今后的临床试验提供了依据。