耳聋突变基因携带孕妇的配偶基因测序研究

曾 黎，尚晶晶，刘正立，石亮程，柳 钐

(1.湖南省长沙市妇幼保健院遗传科 410007；2.河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018；3.北京博奥晶典生物技术有限公司，北京 101111)

听力障碍会严重影响人类的生活，根据世界卫生组织(WHO)的分级标准，当听力损失超过40 dB及以上时，定义为耳聋[1]。根据中国人群流行病学调查分析，目前中国人群耳聋基因携带率为5%[2]，而目前60%以上的新生儿耳聋是由遗传因素所导致[3]。遗传性耳聋主要分为综合征型耳聋和非综合征型耳聋，其中非综合征型耳聋约占70%[4]。在分子诊断技术的迅速发展以及大力倡导精准医学的背景下，基因芯片检测目前已成为检测遗传性耳聋的主要方法。流行病学研究表明，中国人群的主要遗传性耳聋致病基因是4个，分别为GJB2、SLC26A4、GJB3和MT-RNR1(线粒体12S rRNA)[2]。通过对婚育人群和孕妇群体进行4个耳聋基因的热点突变筛查，实现一级预防和二级预防，达到遗传性耳聋的早发现、早预防、早治疗[5]，这也是目前预防耳聋患儿出生最为经济、有效的方法。尤其是对于高危人群，选择产前诊断技术可有效避免遗传性耳聋患儿的出生，为家庭和社会减轻负担。

1 资料与方法

1.1一般资料 受检对象来自2017年4-12月在长沙市妇幼保健院遗传科就诊孕妇(均为耳聋基因携带者)的配偶78例。耳聋基因携带孕妇是从1 951例孕妇中筛查得到，均已进行9项遗传性耳聋基因检测。

1.2方法

1.2.1采样 抽取受检者外周血1～3 mL，乙二胺四乙酸抗凝。

1.2.2测序位点 GJB2基因全长，SLC26A4基因18个外显子区域，GJB3基因全长，MT-RNR1全长。

1.2.3Sanger测序 当孕妇进行耳聋热点突变基因筛查时，若筛查结果为携带者，对孕妇配偶相应的基因进行测序，Sanger测序试验委托北京博奥医学检验所进行，并出具第三方检测报告。

1.2.4产前检测 若夫妻双方为同一耳聋突变基因携带者，经夫妻双方知情同意签字，在B超定位引导下行羊膜腔穿刺术，抽取羊水8～10 mL用于Sanger测序。

2 结 果

2.1孕妇配偶耳聋基因检测情况 在受检的78例孕妇配偶个体中，共检出12例耳聋基因携带者，见表1。

表1 孕妇配偶耳聋基因检测情况

2.2产前诊断 对4对耳聋突变基因携带夫妇进行遗传指导，告知先天性儿聋发生的概率和风险(GJB2和SLC26A4基因突变致聋属于常染色体隐性遗传，生育患儿的风险为25%)，4对夫妻均接受了产前诊断，见表2。

表2 4对耳聋突变基因携带夫妇产前诊断情况

注：-表示无数据

3 讨 论

目前临床上对遗传性耳聋缺乏有效的治疗手段，部分耳聋患儿虽借助助听器或人工耳蜗改善听力状况，但大多数因未能及时诊治而影响生活与学习，给整个家庭带来沉重负担[6]。近20年来，我国的出生缺陷率呈上升趋势，目前出生缺陷总发生率约为5.6%，有研究表明，80%的听力障碍患者都是由听力正常的父母所生。

在倡导精准医疗的大背景下，基因芯片技术目前已成为耳聋基因检测的主流技术，性价比也逐渐显现，将基因筛查纳入婚前和孕前检查，实现出生缺陷一级和二级预防[5]，是目前临床的主流选择。本研究共对78例耳聋基因携带孕妇的配偶进行相应突变位点测序，发现耳聋基因突变12例，其中109G>A共5例，608T>C共2例，235delC共1例，2168A>G共1例，IVS11+47T>C共1例，754T>C共1例，*69G>A共1例。

109G>A(NM_004004：p.Val 37 Ile)位于GJB2基因EXON2，在109位点G突变为A，氨基酸由缬氨酸(Val)突变为异亮氨酸(Ile)，109G>A纯合突变可能与轻中度(25～40 dB)听力损失相关[7]，但是目前还具有一定的争议性，未纳入产前诊断。608T>C(NM_004004：p.Ile 203 Thr)位于GJB2基因EXON2，氨基酸由Ile突变为苏氨酸(Thr)，该位点比较保守，但是根据已有参考文献与案例，目前认为其属于多态[8]。IVS11+47T>C(NM_000441:c.1341+47T>C)位于SLC26A4基因Intron11，已有文献认为其属于多态[9]，但是在耳聋人群中发现比例较高，致病性不明确[10]。754T>C属于显著致病性位点，并且有试剂盒纳入筛查范围[11]，本次筛查的754T>C位点也是最先在耳聋先证者中获得。*69G>A位点属于3`UTR区，还未有相关报道，致病性不明确。

GJB2基因在先天性耳聋患者中最为常见，SLC26A4基因在后天突发性耳聋人群中最为常见，与大前庭导水管综合征(LVAS)高度相关。MT-RNR1基因位于线粒体上，临床上主要与药物性耳聋相关，常呈现家族性，一般不作为产前诊断的依据，GJB3基因致病性与临床相关性不是非常明确，目前不作为产前诊断的依据[12-13]。

GJB2基因定位于13q11-12，属于常染色体隐性遗传，DNA全长4 804 bp，编码区长678 bp。GJB2基因编码的缝隙连接蛋白26(Cx26)属于缝隙连接蛋白基因家族，调节K+的运输，Cx26蛋白在人类的耳蜗毛细胞中高表达[14]。突变会导致移码突变，产生无功能蛋白质，使K+回流进入内淋巴液的循环受阻，导致Corti氏器的钾中毒，从而引起感音神经性聋[15]。在本研究中在耳聋基因携带孕妇的配偶中发现两例致病性耳聋突变，1例为父方299delAT杂合，母方235delC杂合，经家属同意，Sanger测序诊断腹中胎儿在测序位点范围内为235delC杂合；1例为父方235delC杂合，母方235delC杂合，经家属同意，Sanger测序诊断腹中胎儿在测序位点范围内为235delC杂合突变。在测序研究过程中有许多受检者还发现109G>A突变，由于临床意义不明确[15]，不进行产前诊断。另外还发现79G>A，341A>G多态，在人群中检出率较高，不纳入产前诊断。

SLC26A4基因定位于7q22-31.1，属于常染色体隐性遗传，含有21个外显子，编码含有780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin是一种跨膜蛋白，属于离子转运体26A家族，主要在甲状腺、肾脏和内耳中高表达。研究表明Pendrin主要与Cl-、I-、HCO3-和蔗糖转运有关[16]。此次发现有1例孕妇生育第一胎为听力障碍患者，经过Sanger测序确诊是SLC26A4基因387delC/754T>C复合杂合突变(父方754T>C杂合突变，母方387delC杂合突变)导致听力障碍，经过家属同意，进行羊水穿刺诊断，经过测序诊断腹中胎儿为387delC单杂合突变，预测胎儿听力正常。另外一对夫妇是父方为2168A>G杂合，母方为IVS7-2 A>G杂合，经过测序诊断腹中胎儿在测序位点范围内为野生型，预测听力正常。

对于耳聋发生的高危人群，应明确耳聋病因，实现出生缺陷的一级预防[13]，从而减少耳聋出生缺陷，提高人口素质，这对我国妇幼保健工作具有重要的临床意义和研究价值。