大鼠半月板纤维软骨细胞的分离、培养与鉴定

杨军英，林金艳，韩 菲

(河南师范大学体育学院，河南新乡 453007)

半月板作为膝关节的重要结构部分，具有稳定膝关节、维持运动协调，吸收震荡、承载及分散负荷，润滑关节、增加关节接触面等功能.半月板承受着至少50% 的膝关节压力，是膝关节运动损伤中比较常见的损伤部位.半月板损伤可分为退变性和创伤性2种，前者是长期磨损累积而致，发病人群多见于中老年人；后者常见于膝关节运动的急剧转变而使半月板被动运动后的撕裂损伤，属运动损伤范畴，多见于专业运动员及体育爱好人群.运动损伤是常见且易导致机体长时间功能障碍的疾病，而半月板的血供特点决定了其在损伤后，尤其是中央游离缘非血供区损伤后，几乎不具备愈合能力[1].故半月板的损伤是导致膝关节功能紊乱的最常见原因之一，因此,半月板损伤的修复治疗一直以来都是运动医学研究的热点和难题.

组织工程技术修复半月板损伤，主要包括半月板种子细胞、半月板支架材料和细胞因子研究这3部分,其中半月板种子细胞包括半月板纤维软骨细胞、间充质干细胞和多能纤维细胞等.该技术尽可能地保留半月板的形态和功能，克服了半月板部分切除术的局限性和术后出现的功能缺陷以及并发症等问题[2-3]，在临床上取得了一些令人欣喜的进步.叶川等[4]研究发现胚半月板细胞的优化获取方法；Kang等[5]分离兔半月板纤维软骨细胞并用于同种异体组织工程半月板修复.但目前使用的种子细胞面临分化[6]、表型改变[7]、诱导和调控复杂、癌变潜能等问题[8].本研究通过分离培养半月板细胞，分析其生物学特征变化，为体外探究半月板损伤的机制和细胞治疗中种子细胞(半月板纤维软骨细胞)的优选提供理论和实践基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6周龄健康SD大鼠，体重280±20 g,由河南省干细胞和生物治疗研究中心提供.

1.1.2 主要试剂及设备 Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Gibco),Rabbit Anti-Collagen Ⅱ、FITC-羊抗兔 IgG(武汉博士德生物技术有限公司),甲苯胺蓝染色剂(Sigma),二甲基亚砜(Genview),胎牛血清，低糖DMEM(Gibco)等.

CO2细胞培养箱、低温冷冻离心机(Thermo)、倒置相差荧光显微镜(Nikon)、200目铜网(Sigma)、超净工作台(Heal Force)等.

1.2 实验方法

1.2.1 半月板细胞的分离、培养 麻醉并处死42 d龄SD大鼠后，无菌条件下打开膝关节，剥离双膝内外侧半月板.于超净工作台完成以下操作：PBS 缓冲液冲洗3次，眼科剪将组织剪碎约1 mm3大小，在37 ℃ 水浴下，先用0.25%胰蛋白酶预消化1 h，再用20倍组织块体积的0.2% Ⅱ型胶原酶震荡消化 8～10 h，加入培养液终止消化，800 r·min-1离心 5 min，收集细胞，加入含体积分数0.10的FBS,105 U·L-1的青霉素钠、105g·L-1链霉素的DMEM培养液重悬细胞.台盼蓝染色，血细胞计数板计数后，单细胞悬液以1×106个·mL-1接种于 25 cm2培养瓶，置于 37 ℃,5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养.隔日换液1次，用倒置相差显微镜观察细胞形态变化和生长情况.当细胞铺满瓶底(80%～90%融合)时，用含0.1% EDTA的0.25% 胰蛋白酶消化，含10% FBS的DMEM培养液终止消化，将细胞悬液按1∶2 比例传代、培养.

1.2.2 形态学观察 倒置相差显微镜下观察各代细胞的形态，分析细胞生长状况及规律.

1.2.3 甲苯胺蓝染色 第3代半月板细胞爬片48 h，PBS 冲洗 3 次，4% 多聚甲醛固定30 min，1%甲苯胺蓝染色2 h，爬片用无水乙醇迅速漂洗2次，干燥后中性树胶封片.

1.2.4 Ⅱ型胶原免疫荧光染色 将第3代半月板细胞接种于 96 孔细胞培养板，常规培养 48 h 后，PBS 冲洗，4% 多聚甲醛固定1 h，0.5% Trixton X-100 清洗，山羊血清室温封闭 1 h.按照说明书进行以下操作：加入Rabbit Anti-CollagenⅡ 抗体4 ℃ 过夜，加入FITC-羊抗兔IgG，于37 ℃ 恒温箱避光孵育 1 h，PBS 清洗后进行 DAPI 复染.镜下观察并拍照.

2 结果

2.1 形态学观察

原代半月板细胞呈小圆球形，悬浮状态.经台盼蓝染色计算，分离提取的细胞存活率高于 90%.原代半月板纤维软骨细胞贴壁较慢，接种后 6～10 h开始贴壁，48 h 后可完全贴壁.分裂增殖速率也较缓慢，8～10 d 可将 25 cm2培养瓶铺满.贴壁后的细胞逐渐增大、伸长并形成突起，形态以多角形为主；胞核为椭圆形或圆形，位于胞体的中心.在第 1～3 次的传代后，细胞贴壁时间缩短、增殖速度加快，一般可在 4～6 h 贴壁，5～6 d 铺满培养瓶.传至 3 代后，细胞增殖速度减慢，细胞体积变大、形态逐渐变为长梭形；传至第5代后，细胞活力和增殖能力下降、形态不规则、相邻细胞间胞质连接松散、胞浆和胞膜不清晰.各代细胞形态见图 1.

A.原代；B.第1代；C.第2代；D.第3代；E.第5代；F.第7代

2.2 甲苯胺蓝染色结果

细胞爬片经甲苯胺蓝染色后，细胞质呈淡蓝色，细胞核呈深蓝色，核仁清晰，细胞周围有少量异染颗粒.3代以内的半月板细胞的甲苯胺蓝染色明显，随着细胞传代次数的增加，染色逐渐变浅，软骨细胞特征逐渐减弱，结果见图 2.

A.第1代；B.第3代；C.第5代

2.3 Ⅱ型胶原免疫荧光染色结果

细胞贴壁牢固后，经Ⅱ型胶原染色和 DAPI复染.倒置相差荧光显微镜下观察可见，胞质经 FITC 染色后在蓝光激发下呈清晰绿色，为阳性结果，胞核区域未着色，即Ⅱ型胶原于细胞质中表达.细胞核经 DAPI染色后，在UV滤光片下呈蓝色.Ⅱ型胶原免疫荧光染色可见,3代以内的半月板细胞，阳性反应明显；随着传代次数的增加，尤以5代后的半月板细胞，胞浆内绿色荧光明显减弱、阳性率降低(图3).

A.第1代；B.第3代；C.第5代；A1B1C1.光镜下半月板细胞；A2B2C2.Ⅱ型胶原免疫荧光染色；A3B3C3.DAPI复染；A4B4C4.A2B2C2和A3B3C3叠加图

图3 半月板细胞的Ⅱ型胶原免疫荧光染色(10×20,标尺=50 μm)

Fig 3Collagen typeⅡimmunofluorescence staining of meniscus cells

3 讨论

半月板修复的方法因损伤类型而异，早在 1885 年，Annadale 首次报道半月板开放式全切手术可缓解患者症状、改善膝关节功能[9]；Kessler 等认为针对半月板无血区域撕裂损伤，若修补后愈合效果不佳，则部分切除术是其常见的治疗方法[10]；而有学者表明半月板全切或部分切除手术会不可避免地导致半月板撕裂等手术风险，研究显示该手术风险的高低与患者年龄相关(年龄≤40岁的患者风险升高)，此外可采用同种异体半月板或假体进行移植修复，该方法在取得一定疗效的同时也存在排斥反应及移植体回缩等弊端[11-12].

鉴于半月板切除移植重建的效果并不理想，且随着组织工程技术的发展推进，利用组织工程技术再造半月板成为国内外不少学者研究的热点[13].Zellner 等研究表明,自体 MSCs 和半月板细胞在动物模型中具有改善半月板愈合的功能[14]；Kim等研究发现载有纤维软骨细胞及 TYR 交联的水凝胶具有修复半月板的潜在价值[15].原代培养的半月板细胞是研究半月板损伤机制的最好载体，也是目前种子细胞最佳和应用最广泛的细胞来源[16].但半月板主要由纤维软骨细胞和大量基质构成，随着年龄增长，细胞成分含量减少，而胶原纤维含量则逐渐增加，其获取存在一定难度[17].本研究采用机械分离与酶消化相结合的方法，获得了活性大于95%的组织细胞，而且步骤简单，降低污染机会，减少半月板纤维软骨细胞的损伤，并且获取的细胞数量多、纯度高.

已有研究发现，体外单层培养系统中半月板纤维软骨细胞随着传代的进行变为纤维细胞的表型，表现出去分化的现象[7,18].本研究结果显示，原代半月板纤维软骨细胞贴壁和分裂增殖速率较慢.传代后，细胞的贴壁能力和增殖速率大大增强，这可能与细胞受到机械性和化学性的损伤、原代细胞接种时的密度较稀疏及生存环境的改变有关.当细胞传至 5 代后呈现明显的增殖速率下降及衰老现象.细胞形态也由规则、大小均一的多角形变成以长梭形为主.这种变化与文献[8,19]的报道基本一致，可能是因为随着体外培养时间的延长及传代次数的增加，半月板合成基质相关基因表达下降，出现“去分化”现象[7].体外单层分离培养的第 5 代前的半月板细胞基本维持其表型和生物学特性.

软骨细胞一般通过测定聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达进行鉴定.本研究对分离和培养的(5代以内)半月板纤维软骨细胞进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色，实验结果均为阳性.表明其保留稳定的半月板纤维软骨细胞表型，具有良好的生物学活性及功能.

4 结束语

采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化半月板组织、低糖 DMEM 完全培养液常规培养的方法，可获取纯度及活性程度均较高的半月板纤维软骨细胞.第4代之前的半月板纤维软骨细胞能够保持良好的生物学特性，可以为半月板运动损伤的组织工程学研究提供种子细胞.