菰黑粉菌中尿素水解酶基因UeUal的克隆及表达分析

葛倩雯,张雅芬,叶子弘,俞晓平

(中国计量大学 生命科学学院 浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江 杭州 310018)

茭白(Zizanialatifolia),古称“菰”.由于其肉质鲜美、营养价值高而深受人们的喜爱[1].在田间,茭白主要有三种表型：会抽穗开花的雄茭,肉质茎饱满白嫩的正常茭以及切开后充满灰色冬孢子堆的灰茭.研究发现,茭白肉质茎膨大是由于其内生真菌——菰黑粉菌(Ustilagoesculenta)的侵染增殖引起的.其中未膨大的雄茭中未检测到菰黑粉菌的存在,而在茎基部膨大的灰茭和正常茭中,其抽穗开花均受到抑制,且灰茭植株中营养缺乏且茭肉的薄壁组织细胞分裂缓慢,液泡化明显,氧化胁迫程度高.另外,灰茭中菌丝细胞与寄主细胞表面凹陷处形成了一个包含内外两层基质的隔膜：正常茭白组织细胞的外层基质更厚,灰茭组织细胞的内层基质更透明.进一步研究表明,菰黑粉菌的菌株致病力分化致使其与茭白植株互作差异从而导致田间灰茭和正常茭的产生[2].在正常茭中分离得到的菰黑粉菌菌株称为MT(mycelia-teliospore)型菰黑粉菌,多以菌丝态出现,且在茭白膨大后期才出现少量冬孢子;从灰茭中分离得到的菌株称为T(teliospore)型菰黑粉菌,在茭白膨大过程中主要以冬孢子的形式存在[3].大量研究表明：T型与MT型菰黑粉菌在致病力上存在显著差异,其中MT型菌株对环境更为敏感[4-6].

菰黑粉菌属于担子菌亚门黑粉菌属,与玉米瘤黑粉菌近源,是典型的二态性真菌[7].有研究发现：玉米瘤黑粉菌接受植物表面信号后,异质单倍体相互交配融合生成双核菌丝.双核菌丝顶端产生附着胞后可直接穿透寄主表皮,待成功入侵寄主后菌丝在寄主细胞间隙增长,并引起侵染部位细胞膨大,组织出现瘤变.进一步研究发现酵母型玉米瘤黑粉菌没有侵染能力,其转变成双核菌丝后才具有侵染能力.而在茭白膨大过程中,同样伴随着菰黑粉菌在茭白植株内形成大量双核菌丝的现象.近期,我们对菰黑粉菌的生活史研究发现：当两个性亲和的单倍体相遇后才能形成具有侵染能力的双核菌丝.而菰黑粉菌双核菌丝的生成是其侵染茭白植株的关键步骤[4].因此我们推测：与玉米瘤黑粉菌类似,菰黑粉菌的二型态转换能力的差异是其致病力差异的主要影响因子.

为了明确菰黑粉菌二型态转换的关键影响因子,我们进行了不同碳氮源条件对菰黑粉菌二型态转换的影响研究,发现精氨酸能促进MT型菰黑粉菌的二型态转换及菌丝生长,却抑制了T型菰黑粉菌的二型态转换及菌丝生长[4].同时通过菰黑粉菌的全基因组测序结果分析,在菰黑粉菌中,精氨酸通过精氨酸酶水解形成尿素,尿素可通过尿素水解酶进一步分解形成CO2.为了进一步明确精氨酸对二型态转换的作用机理,我们对其代谢途径中的关键酶基因尿素水解酶进行了克隆,并通过序列比对、构建进化树等方法确定了菰黑粉菌中编码尿素水解酶的基因UeUal.利用荧光定量PCR检测UeUal在菰黑粉菌融合过程中相对表达量的变化,分析发现该基因在融合后期菌丝生长阶段表达量升高,推测该基因可能在菰黑粉菌二型态转换的后期起作用.

1 材料与方法

1.1 菌株及培养条件

本实验以龙茭2号灰茭中分离出的UeT14,UeT55菰黑粉菌菌株以及龙茭2号正常茭中分离出的UeMT10,UeMT46菰黑粉菌菌株为实验材料.本实验中,菰黑粉菌均培养于YEPS(1%酵母提出物,2%蔗糖,2%胰蛋白胨)培养基上,培养温度为28 ℃.

1.2 基因克隆

采用CTAB法提取菰黑粉菌基因组DNA(gDNA)[11].使用柱式真菌总RNA提取纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司,NO. B518659)提取菰黑粉菌RNA并用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技有限公司,NO. R212-01)反转录成cDNA.以菰黑粉菌全基因组数据为参考,在NCBI中找到稻瘟菌、玉米黑粉菌、大麦坚黑粉菌等近源物种中尿素水解酶的序列,比对分析该基因在菰黑粉菌中的预测序列.根据预测序列设计扩增该基因的特异性引物UeUal-F、UeUal-R(表1),分别以菰黑粉菌的gDNA和cDNA为模板进行基因扩增.克隆得到的片段送上海桑尼生物科技有限公司测序.

表1 实验相关引物序列

1.3 生物信息学分析

用Clone manger软件进行多序列比对,分析UeUal基因cDNA序列与gDNA序列的差异,分析是否含有内含子.将UeT14,UeT55,UeMT10,UeMT46菌株DNA为模板克隆得到的UeUal基因序列用Clone manger进行多序列比对,分析四个菌株间序列差异.通过ExPasy网站预测UeUal蛋白分子的理化特征.利用https://web.expasy.org/compute_pi/网站,在线预测蛋白的相对分子质量与等电点.利用http://smart.embl-heidelberg.de/网站预测UeUal基因翻译的蛋白中的可能的结构域.利用MEGA软件中近邻法构建系统进化树.

1.4 体外融合实验

将菰黑粉菌UeT14,UeT55,UeMT10,UeMT46菌株活化,经液体培养至OD600约1.0后,用YEPS液体培养基将OD600调至2.0.各取2 μL菌液进行两两混合(UeT14和UeT55,或UeMT10和UeMT46)后点样于YEPS平板上,每隔12小时在光学显微镜下观察菌株融合及菌丝生长情况,在体式显微镜下观察融合过程中菌落形态变化.同时刮取菌落样品于2.0 ml离心管内,液氮速冻20 s后放于-80 ℃冰箱保存,用于后续基因表达模式分析实验.

1.5 基因表达模式分析

将融合过程中取样的样品用柱式真菌总RNA提取纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司,NO.B518659)分别提取总RNA.提取的菰黑粉菌总RNA用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for Qpcr(+gDNA wiper) (南京诺唯赞生物科技有限公司,NO.R212-01) 进行反转录得到cDNA.荧光定量PCR反应体系(20 μL):SYBR染液10 μL,Primer-F/R 1 μL,cDNA Template 0.5 μL,加无菌水至20 μL. 荧光定量PCR 反应程序：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 30 s,60 ℃ 20 s,72 ℃延伸30 s,从第二步开始做40个循环,每个反应做3次重复.根据UeUal基因序列,设计特异性荧光定量PCR引物(表1),以β-Actin为内参,检测UeUal基因表达量.将T型菰黑粉菌0 h的样品作为对照,分析UeUal基因的在T型菰黑粉菌融合过程中的表达模式.将MT型菰黑粉菌0 h的样品作为对照,分析UeUal基因在MT型菰黑粉菌融合过程中的表达模式.用SPSS对数据做显著性差异分析,用Excel作图得到UeUal基因表达模式图.

2 结果

2.1 UeUal基因的克隆

在三代测序得到菰黑粉菌全基因组序列基础上，结合在NCBI数据库找到玉米黑粉菌中尿素水解酶基因序列,预测得到菰黑粉菌中的同源基因g3060.通过设计特异性引物UeUal-F/UeUal-R,以菰黑粉菌DNA为模板,克隆得到g3060基因的gDNA(图1).提取菰黑粉菌总RNA,经反转录得到cDNA.以cDNA为模板,用特异性引物UeUal-F/UeUal-R克隆得到g3060基因的ORF序列.分别将克隆得到的片段导入大肠杆菌中,送上海桑尼生物科技有限公司进行测序.通过clone manager软件对gDNA和cDNA进行多序列比对,发现两个序列无差异,说明该基因无内含子.其开放阅读框长度为2598 bp,编码氨基酸序列长度为865个氨基酸.经ExPasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)对其编码的蛋白理化性质进行预测后可知,该蛋白的相对分子质量为92.16 kDa,理论等电点为5.74.进一步分析发现,该基因翻译的蛋白与尿素水解酶蛋白的同源性较高,命名为UeUal(GenBank登录号MH230282).

1—2 598 bp长度的基因组DNA扩增片段;2—2 598 bp长度的cDNA扩增片段；M—DNA Maker(DL5000DNA Maker,南京诺唯赞生物科技有限公司,NO.MD102);箭头所指的都是测序的条带.图1 UeUal基因cDNA和基因组片段扩增琼脂凝胶电泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of the UeUal cDNA and genomic fragments

分别以菰黑粉菌UeT14,UeT55,UeMT10,UeMT46菌株DNA为模板,克隆UeUal的基因组序列.用Clone manager软件对4个菌株的UeUal基因组系列做多序列比对后我们发现,如图2,T型菌株序列两两相同,MT菌株序列两两相同,但T型与MT型间存在个别碱基的差异.在ORF编码框中,个别碱基的突变也造成了编码的氨基酸的改变.进一步分析ORF编码框中氨基酸的变化,我们发现在整个ORF编码框中T型与MT型氨基酸序列共存在6处氨基酸的差异,他们分别存在于所编码的第2、136、214、267、313以及386位氨基酸处(表2).

图2 菰黑粉菌UeT14,UeT55,UeMT10,UeMT46菌株中UeUal基因序列差异示意图Figure 2 The difference of UeUal gene sequence in UeT14, UeT55, UeMT10 and UeMT46

氨基酸位置氨基酸变化情况(T型→MT型)第2位组氨酸→酪氨酸第136位亮氨酸→丝氨酸第214位苯丙氨→酸丝氨酸第267位丙氨酸→缬氨酸第313位谷氨酸→谷氨酰胺第386位丙氨酸→苏氨酸

2.2 UeUal蛋白系统发育分析与结构分析

在NCBI上下载得到菰黑粉菌近源物种酵母、玉米黑粉菌、玉米丝黑穗菌等真菌中尿素水解酶蛋白序列.在MEGA软件中采用Clustal W进行序列比对,用近邻法(NJ)构建系统进化树.根据进化树可知,菰黑粉菌尿素水解酶蛋白与宾地瘤黑粉菌尿素水解酶蛋白间遗传距离相近(图3),同源性较高.尿素水解酶是一类镍依赖的金属酶.该酶包括α、β和γ三个亚基,他们可以作为单独的蛋白质存在,也可以结合在同一个蛋白链上.每个尿素水解酶全酶包含四个结构域[12-13],包括三个亚基结构域和一个镍结合催化域[14].将UeUal蛋白序列放入http://smart.embl-heidelberg.de/进行蛋白结构预测.菰黑粉菌尿水解酶蛋白中包含尿素酰胺水解酶γ亚基区域、尿素水解酶α亚基区域、尿素水解酶β亚基区域以及1个酰胺氢区域(图4),与前人研究相符合.在该序列编码的氨基酸链的1-100位氨基酸构成了一个尿素水解酶γ亚基区域,第144-243位氨基酸构成了尿素水解酶β亚基区域,第284-404位氨基酸构成了尿素水解酶α亚基区域,第410-758位氨基酸构成了酰胺氢区域.

注：宾地瘤黑粉菌Melanopsichium pennsylvanicum 4(CDI56612.1),禾柄锈菌Puccinia graminis(XP 003322447.2),新型隐球菌Cryptococcus neoformansJEC21(XP 572365.1),玉米黑粉菌Ustilago maydis 521(XP 011392409.1),玉米丝黑穗菌Sporisorium reilianum SRZ2(CBQ71321.1),大麦坚黑粉菌Ustilago hordei(CCF48991.1),酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae(NP 009767.1)图3 UeUal蛋白系统发育树Figure 3 Phylogenetic tree of UeUal protein

图4 UeUal蛋白结构域预测Figure 4 UeUal protein domain prediction

2.3 UeUal基因表达模式分析

前期研究发现酵母型菰黑粉菌无法侵染茭白植株,只有菌丝型菰黑粉菌具有侵染茭白植株的能力.且T型和MT型菰黑粉菌在融合能力、致病力等方面均存在差异.为进一步研究UeUal基因对菰黑粉菌融合的影响,本研究分别提取T型和MT型菰黑粉菌体外融合实验不同时间段的样品总RNA,反转录成cDNA后做荧光定量PCR检测UeUal基因的表达量.将T型菰黑粉菌0 h的样品作为对照,分析UeUal基因在T型菰黑粉菌融合过程中的表达模式.将MT型菰黑粉菌0 h的样品作为对照,分析UeUal基因在MT型菰黑粉菌融合过程中的表达模式.从荧光定量PCR的结果分析我们可以知道,在T型菌株融合过程中UeUal基因在前期持续呈低表达状态.直至36 h时,UeUal基因表达量显著性升高.36 h后,UeUal基因表达量持续升高(图5A).在MT型菌株融合过程中UeUal基因在前期持续呈低表达状态.直至48 h时,UeUal基因表达量显著性升高.48 h后,UeUal基因表达量仍然显著性升高(图5B).结合菌株融合的表型来看,T型菌株在36 h时能够在体视显微镜下观察到融合菌丝;MT型菌株在48 h时能够在体式显微镜下观察到融合菌丝(图5C).该时期,UeUal基因表达量均显著性升高,推测该基因可能作用于融合菌丝生长时期.

3 讨论

茭白作为我国第二大水生蔬菜,具有较高的经济价值与营养价值.菰黑粉菌与茭白互作导致茭白植株茎部膨大形成可食用茎.研究发现,菰黑粉菌由酵母型向菌丝型转变是其侵染茭白植物的关键.前期研究表明,精氨酸水解产生的尿素可能通过尿素水解酶水解从而产生CO2,作用于真菌二型态转换[8].本文基于菰黑粉菌的全基因组测序结果,以模式生物玉米黑粉菌中尿素水解酶序列为参考,预测得到了菰黑粉菌中尿素水解酶相关序列,并设计了特异性引物,第一次克隆得到了菰黑粉菌中尿素水解酶基因.通过同源性比对及系统进化树分析确认,并将其命名为UeUal.进一步分析其蛋白结构功能域,发现该蛋白是一个完整的尿素水解酶,包含尿素水解酶α、β、γ亚基及镍结合催化域(图4).

A—UeUal基因在T型菰黑粉菌融合过程中表达量变化图;B—UeUal基因在MT型菰黑粉菌融合过程中表达量变化图;C—菰黑粉菌T型与MT型菌株融合菌落显微图(Bar=100μm)图5 UeUal基因表达模式分析图Figure 5 Expression analysis of UeUal gene

已经有研究表明,精氨酸水解产生的尿素通过尿素水解酶水解产生的CO2能够激活Ras调节腺苷酸环响应cAMP信号途径[15-16],激活白念珠菌二型态转化开关基因Efg1p,诱导菌丝生成[17-18].为了研究尿素水解酶在菰黑粉菌二型态转换过程中的作用,我们分别以T型与MT型融合菌株不同时间点菌株样品模板,通过荧光定量PCR测定UeUal基因的相对表达量.结果发现,该基因在融合菌丝生长阶段呈高表达状态,且后期呈持续升高趋势(图5A).推测该基因可能作用于融合菌丝生长阶段.但是UeUal基因对菰黑粉菌二型态转化的影响,以及其是否通过水解尿素产生CO2来介导cAMP信号途径,从而影响菰黑粉菌的融合能力和侵染能力，仍需要大量实验来验证.我们有必要通过分子手段敲除UeUal基因,进而对该基因在菰黑粉菌性亲和单倍体间融合能力及菰黑粉菌侵染茭白过程中的作用做进一步验证.