蜜环菌的优化培养研究

梁 艳 ，苏朝棉 ，周西贝 ，王鹏辉 ，郭 尚 ，王 华 ，张作刚

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.南和县农业局，河北南和054400；3.山西省农业科学院食用菌研究所，山西太原030031）

蜜环菌（Armillaria mellea）又名榛蘑、蜜环蕈、苞谷蕈、青冈蕈等，是隶属于担子菌亚门的一种药食兼用真菌，能兼性寄生于多种木本、草本植物等树干基部、根部或倒木上[1-2]，广泛分布于亚洲、欧洲、北美洲等地的温带地区，主要分布于我国20多个省区[3-5]。在传统中药材天麻、猪苓等的生长过程中，蜜环菌与它们之间存在极为特殊的营养关联，是其必不可少的共生菌[6]。菌索入侵天麻的块茎或猪苓的菌核后被其消化吸收，为它们提供营养[7-10]。蜜环菌菌索多生长于树根组织中或土壤中，其功能高度分化，不仅可以运送养分，还能生长分化，形成子实体，对不良环境有较强的抵抗力[11-14]。目前，国内外对于蜜环菌的研究和探索，主要集中于生物学特性、化学成分、人工培养、与天麻的共生关系、药理作用以及相关药品的开发等方面[15-17]。其中，关于蜜环菌的人工培养是人们所关注的重要方面，进一步研究和探索蜜环菌的培养，对于蜜环菌的研究和开发具有重要意义。

本试验研究了不同培养基质对蜜环菌萌发时间、生长速度、菌索品质和生长量的影响，以期筛选出最佳的蜜环菌生长条件，为蜜环菌的人工培养及工业化生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 蜜环菌由河南卢氏提供。

1.1.2 培养基组分及试剂 胡萝卜、松针、豆油、麸皮、苹果枝、木屑、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、蛋白胨、牛肉膏、尿素、琼脂、乙醇、磷酸氢二钾、硫酸镁、维生素B1。

1.2 方法

1.2.1 不同碳源、氮源、培养基形态及活化时间对蜜环菌萌发和生长的影响

1.2.1.1 不同碳源培养基的制备 基础培养基：马铃薯200 g，磷酸氢二钾3 g，硫酸镁1.5 g，琼脂粉20 g，维生素 B110 mg，水 1 000 mL，pH 自然。分别在基础培养基中加入葡萄糖20 g，蔗糖20 g，麦芽糖20 g，淀粉20 g，制成不同的碳源培养基，保持培养基中碳含量等量，按照编号分装到试管中，灭菌，接入蜜环菌观察并记录菌种的萌发和生长情况。每个配方重复3次。

1.2.1.2 不同氮源培养基的制备 制备基础培养基，分别在基础培养基中加入蛋白胨、牛肉膏、尿素各5g，制成不同的氮源培养基，保持培养基中氮含量相等，按编号分装到试管中，灭菌，接入蜜环菌观察并记录菌种的萌发和生长情况。每个配方重复3次。

1.2.1.3 不同琼脂含量的培养基制备 制备基础培养基，保持培养基中碳、氮含量及成分相同，琼脂的添加量按 0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%这 5个浓度梯度，按编号分装到180 mL的试管中，灭菌后，接入蜜环菌观察并记录菌种的萌发和生长情况（表1）。每个配方重复3次。

1.2.1.4 不同活化时间 将在冰箱冷藏的蜜环菌菌种放到25℃的恒温培养箱中活化，设置活化时间为 12，24，36，48，60 h，并进行编号。将活化好的菌种接种到不同培养基，3次重复，并放到25℃的恒温培养箱中进行培养，每隔12 h观察并记录菌种的萌发和生长情况一次，共记录5次。

1.2.2 不同母种培养基对蜜环菌生长的影响 按表2制作7种培养基，高压灭菌后，接种蜜环菌，25℃避光培养，14 d后冲洗掉蜜环菌索上附着的琼脂，70℃下烘干至恒质量，称取质量即为每瓶收获的生物量。观察记载蜜环菌菌索萌发所需时间、菌索密度、菌索顶端整齐度及生长满瓶所需的天数。同上，制作7种培养基，将等量的培养基分装在试管内，灭菌后接种蜜环菌，25℃避光培养，每3 d测量蜜环菌菌索的生长长度。每个配方重复3次。

表2 不同母种培养基的配方

1.2.3 不同栽培种培养基对蜜环菌生长的影响选择直径1 cm左右的苹果树枝，截成长6 cm的枝段，并将两端削成斜面。将苹果枝、玉米芯在0.25%硝酸铵溶液中浸泡2 h，将胡萝卜捣成泥。如表3制作4种培养基各250 mL，加入营养液至刚好淹没固体。高压灭菌，接种于三角瓶中，25℃避光培养14 d。菌索长满瓶后，用温水冲洗蜜环菌索，挑去杂质木屑，70℃下烘干至恒质量，称取质量即为每瓶收获的生物量。每个配方重复3次。

表3 不同栽培种培养基的配方 %

1.2.4 不同添加物对蜜环菌生长的影响 在1000mL蒸馏水中加入100 g胡萝卜小块，煮20 min，过滤后制成胡萝卜提取液。按体积计算分别添加0，1%，2%，5%，10%的胡萝卜提取液作为处理 1，2，3，4，5，灭菌后，进行接种培养。分别将胡萝卜、乙醇、豆油添加物按表4加入培养基，灭菌，接种蜜环菌菌块后置于摇床，在110 r/min，25℃避光条件下培养14 d。培养出的发酵产物过滤后放入烘干箱中干燥至恒质量，用天平称量。

将松针洗净，60℃烘干并研磨，然后与水以1∶10的比例放入水浴锅，90℃浸提1 h，提取2次，合并提取液，过滤，即制成松针浸提液。分别向PDA培养基添加0，5%，10%，20%，30%的松针浸提液制成培养基，高压灭菌后，将蜜环菌菌块接种于三角瓶中，25℃避光培养7 d后，冲洗掉蜜环菌索上附着的琼脂，70℃下烘干至恒质量，称取质量即为每瓶收获的生物量，观察不同浓度松针浸提液培养基对蜜环菌生长的影响。每种处理3次重复。

表4 液体发酵培养基不同添加物的量 %

2 结果与分析

2.1 不同碳源、氮源、培养基形态及不同活化时间对蜜环菌萌发和生长的影响

2.1.1 对蜜环菌萌发时间的影响 不同碳源、氮源、培养基形态及不同活化时间对蜜环菌萌发时间的影响如表5所示。

表5 不同碳源、氮源、培养基形态及活化时间对蜜环菌萌发时间的影响 d

由表5可知，接种在不含琼脂的1号培养基上的蜜环菌，当活化时间为48 h时，蜜环菌的萌发时间较其他处理显著缩短，为3.8 d。在其他不同琼脂浓度的培养基上，48 h处理的平均萌发时间都最短。在2号（0.5%琼脂）中36 h处理与24，48，60 h处理存在显著性差异，但48 h处理与其他处理相比萌发时间显著缩短；在3号（1.0%琼脂）培养基中，24 h处理与48 h处理存在显著差异，但48 h处理与其他处理相比萌发时间显著缩短；在4号（1.5%琼脂）培养基中，48，60 h处理无显著差异，但48 h处理与其他处理相比萌发时间显著缩短；在5号（2.0%琼脂）培养基中，处理48 h较其他处理萌发时间显著缩短，仅为4.8 d；在6号（蔗糖）培养基中，处理48 h时的蜜环菌萌发时间最短，仅为4.2 d；在7号（麦芽糖）、8号（淀粉）培养基中，36 h处理与48，60 h处理间存在显著差异，48 h处理的蜜环菌较其他处理萌发时间缩短；在9号（蛋白胨）中，12 h处理与36，60 h处理存在差异，60 h处理蜜环菌较其他处理萌发时间缩短；在10号（牛肉膏）培养基中，60 h处理的蜜环菌与其他处理相比萌发时间显著缩短，仅为4.1d；在11（尿素）培养基中各时间梯度不存在显著差异。

2.1.2 对蜜环菌生长状况的影响 把蜜环菌菌种活化48 h后接种到不同培养基上，通过分析得出，随着琼脂的浓度增加，菌索的分支在减少，菌索颜色由白逐渐变黄，菌索形态由纤细逐渐变粗，菌索密度增加；以淀粉为碳源的培养基前期萌发时菌索分支与葡萄糖、麦芽糖、蔗糖相比较多，菌索颜色在加深，菌索形态细弱，菌索密度也很小；以牛肉膏、蛋白胨为氮源的培养基菌索分支很多，三者的菌索颜色都较深，牛肉膏的菌索形态较粗，菌索密度也较大；而尿素为氮源的培养基菌索分支很少，形态纤细，密度较小（表6）。

表6 蜜环菌在不同碳源、氮源及形态培养基上的生长情况

2.2 不同母种培养基对蜜环菌生长的影响

2.2.1 对蜜环菌菌索生长速度的影响 由表7可知，蜜环菌菌索前12 d生长速度快慢依次为：松针、胡萝卜＋PDA、麦麸、牛肉膏、PDA加富、胡萝卜培养基，蜜环菌菌丝生长速度最快的是松针培养基，前12 d平均高达9.88 cm，生长速度最慢的是木屑培养基，前12 d平均长度仅为3.33 cm，松针培养基生长长度是木屑培养基的3倍左右。

表7 不同母种培养基的蜜环菌菌索生长长度 cm

2.2.2 对蜜环菌菌索生物特性的影响 从表8可以看出，蜜环菌菌索萌发所需时间最短的是松针培养基，为3 d；最长的是PDA培养基和胡萝卜培养基，为7 d。蜜环菌生物量最高的是松针培养基，然后依次是牛肉膏培养基、胡萝卜＋PDA复合培养基、木屑培养基、麦麸培养基、PDA加富培养基和胡萝卜培养基。其中，松针培养基的生物量是PDA加富培养基和胡萝卜培养基的9倍。

松针培养基满瓶所需时间最短，为15 d，其次依次是胡萝卜＋PDA、牛肉膏、木屑、麦麸、PDA加富（胡萝卜）培养基。松针培养基和牛肉膏培养基上的菌索浓密大、生长势强、菌索顶端整齐程度高，木屑培养基的生长势弱于松针培养基和牛肉膏培养基，麦麸培养基和PDA加富培养基上的菌索稀少、生长速度慢、菌索顶端整齐程度较差。

表8 不同母种培养基上蜜环菌菌索的生物特性

2.3 不同栽培种培养基对蜜环菌生长的影响

从表9可以看出，4号培养基上的蜜环菌平均生物量为17.07 g/L，明显高于其他培养基，分别是1，2，3 号培养基生物量的 2.91，2.90，1.93 倍，说明4号培养基最适合培养蜜环菌的生长。

表9 不同栽培种培养基对蜜环菌生长的影响

2.4 不同添加物对蜜环菌生长的影响

从表10可以看出，从4种添加物对蜜环菌促长的最大生物量来看，松针浸提液促进蜜环菌生长效果最强，添加量为30%（处理5）时，蜜环菌生物量最高，达30.97 g/L；豆油和乙醇次之，添加量分别在0.2%（处理3）和0.8%（处理4）时，二者蜜环菌生物量最高，分别为13.38，18.23 g/L；胡萝卜添加物的蜜环菌生物量最小，浓度为5%（处理4）时，蜜环菌生物量最高，为7.76 g/L。

表10 培养基添加物对蜜环菌平均生物量的影响 g/L

3 结论与讨论

国内外对蜜环菌的探索主要集中在菌丝、菌索等发酵液的药理成分研究及功效的研究上[18-22]，对人工栽培等方面的相关研究报道较少。本试验结果阐述不同培养物质对蜜环菌菌株萌发及生长性状的影响，从蜜环菌的4种不同培养条件中筛选出在培养基中添加一定量的松针液，更有利于促进蜜环菌的生长。

从不同琼脂添加量对蜜环菌生长的影响情况来看，蜜环菌更适合在菌索生长阻力小的液态培养基中生长。在不同氮源条件培养中，相比尿素培养基，蜜环菌更适合在以牛肉膏和蛋白胨为氮源的培养基环境中生长，说明菌株在生长初期更适合利用牛肉膏和蛋白胨等多种氨基酸蛋白质为营养物质，尿素类单一有机化合物不能充分提供蜜环菌生长所需营养。通过添加松针或松针浸提液，发现能大幅度提高蜜环菌的生长速度和生物量，说明松针当中含有某种物质能够促进蜜环菌生长，因此，还需要对松针提取物中有效成分进行分析。同时，本试验还存在一些需要完善的条件设置，比如不同的温度、光照、pH值以及环境的含氧量高低对蜜环菌生长的影响还需进一步试验探究。