苹果不同授粉方式对果实发育的影响

郭宝贝，张东霞，刘 丽，郑永惠 ，郭成俊 ，雷红婴 ，吴 政 ，郭 媛

（1.山西省农业科学院果树研究所，山西太原030031；2.山西省植物保护植物检疫总站，山西太原030006；3.山西省晋中种蜂场，山西晋中030600；4.山西省农业科学院园艺研究所，山西太原030031）

苹果作为落叶果树中的重要树种，也是享誉世界的4大水果之一，其栽培面积和分布范围都居前列，产量效益可观，在我国农业经济中占据了重要位置。苹果作为异花授粉植物，花粉直感现象在许多果实性状上表现明显，因此，授粉效果是果实品质的重要影响因素[1]。利用蜜蜂为经济作物增产已经为人所熟知[2]，对蜜蜂授粉增产机制的研究主要集中在植物授粉以前的各种优势条件上[3]，如授粉时间最佳、授粉充分、异源花粉授粉优势、充分利用有效花等等[4-5]，然而蜜蜂授粉后对植物花部生理发育的影响却鲜有研究。

本研究通过几种授粉方式对苹果授粉后花部生理发育的比较，探讨蜜蜂授粉的优势，旨在为更好地认识蜜蜂授粉提供新材料。

1 材料和方法

1.1 材料

选取榆次豆腐庄7年生红富士苹果树12株，15 cm×18 cm白蜡纸袋700个；人工授粉粉源采自运城市临猗县张家坡村秦冠和嘎啦混合花粉。

1.2 试验设计

2016年5月1日至6月18日在榆次豆腐庄选取试验样地，共设置自然授粉（N）、蜜蜂授粉（B）、自花授粉（S）和人工授粉（D）4个试验组。每组选取树龄、树势、花量一致的红富士3株。

N组授粉方式为自然授粉；S组在5月1日开始选取气球期花序300个套袋，并在5月3日花盛开当天进行人工自花授粉，此时授粉效果最佳[6]。D组也在5月1日选取气球期花序300个套袋，5月3日采用4月7日在临猗张家坡采集保存的秦冠和嘎啦混合花粉进行人工授粉，花粉保存方法采用王钦丽等[7-8]的方法。授粉时每个花序去除中心花，保留边缘花2朵，花粉用1.5 mL EP管盛装花粉，用铅笔橡皮头适量蘸取花粉，在当天已开花的柱头上点授花粉，授粉后再将袋子套好[9-10]。B组采用蜜蜂授粉，需要套网，网内设置1株红星和3株红富士，选取考察枝，考察枝上保留气球期的花，其他花全部摘除，于5月2日下午将一箱蜂放入，5月3日进行全天授粉，晚上将蜂箱搬离试验棚。

1.3 采样及处理方法

1.3.1 花粉萌发和花粉管生长荧光观察试验 对蜜蜂授粉、人工授粉和自然授粉3个组的花柱分别在 12，24，36，48，72，96 h 进行取样，每组每次处理重复不少于20根，然后放入FAA固定液中保存。由于自花授粉组全部败育，所以未取得花粉管材料。1.3.2 胚、胚乳生长发育情况切片试验 共取样16次，在5月3日授粉后2，4，6，10 h各取样4次，5月 4，5，6日每天 9：00和 16：00各取样 1次。5月15，19，25日，6 月 1，8，18 日每天 16：00取样 1 次。取样时间经历47d。所取样本保存在FAA固定液中。

1.4 指标测定及方法

花粉萌发、花粉管生长荧光观察试验参照KHO的方法[11]，并在软化时间上做适当修改，确定为1 mol/L NaOH 40℃处理6 h，苯胺蓝染色过夜。染色后用Olympus BX51显微镜荧光显微系统观察，并用显微成像系统进行拍摄，每个处理重复不少于20根花柱。

胚、胚乳授粉后生长情况对比采用常规石蜡切片法，取样后立即放入FAA中保存，每个样品取3个重复。用Olympus BX51显微镜放大100倍观察，并用Olympus E620数码照相机拍照。

2 结果与分析

2.1 花粉萌发、花粉管生长情况荧光观察

考察所有时段的采集样品，进行花粉柱头萌发及花粉管生长荧光观察结果统计。苹果柱头花粉萌发和花粉管生长表示方法：花粉柱头萌发情况，0为没有花粉在柱头萌发，1为柱头有弱荧光，2为柱头有强荧光，3为柱头有超强荧光；花粉管生长情况，0为没有花粉在柱头萌发，1为柱头观察到花粉管荧光，2为花柱中部观察到荧光，3为花柱根部观察到荧光。统计数据列于表1，花粉柱头萌发情况和花粉管生长情况如图1所示。

表1 花粉管生长与柱头花粉萌发荧光观察情况统计 个

方差分析显示，在P＜0.01水平上，B组柱头花粉萌发情况与D，N组间差异极显著；B，D组花粉管生长情况与N组间差异也极显著（表2）。

花粉管生长对比试验中，B组、D组间不存在显著差异。说明利用蜜蜂授粉完全可以达到人工授粉的效果[12]；柱头花粉萌发对比中，B组与N，D组间存在极显著差异，并在柱头花粉萌发强度上具有绝对优势。B组在柱头超强荧光的数量上占考察柱头总数的29.66%，而D，N组仅为6.20%和2.88%。3种授粉方式中，蜜蜂在传粉效果上具有绝对优势。

考察花粉管生长情况，花粉管生长到花柱中部的数量占总考察花柱数的比例，D组为35.66%，B组为48.97%；花粉管生长到花柱根部的数量占总考察花柱数的比例，D组为5.43%，B组为1.38%。

表2 苹果柱头花粉萌发和花粉管生长荧光观察结果（P＜0.01，S-N-K方差分析） 个

2.2 胚、胚乳生长情况观察

2，4，6，10，24 h 切片显示，椭圆形胚囊保持完整（图 2-1，2），N，B，S，D 组之间没有明显的差别。受精后48 h珠心细胞开始解体，为胚囊发育提供营养，D组珠心解体程度比其他3组大（图2-3，4）。72 h切片结果同48 h，D组珠心裂解程度较大。

13 d取样切片显示，D组水样状的胚乳正在逐渐消失，胚的发育正在进入加速阶段，要比其他3组发育的快（图2-5，6）。在第17天时，B，D组胚珠的正中间可以看到受精合子，体积扩大，侵蚀四周的珠心细胞，N组中没有观察到（图2-7，8，9）。从13 d起，S组由于受精情况不好，花部逐渐凋零，S组不再取样。

从5月25日即授粉后23 d的切片中看到，B组受精卵开始发育，N组中棒状胚已经形成，D组也看到了受精卵，（图2-10，11）。30 d取样切片观察可以看到，B组已经形成非常典型的心形胚（图2-12）。而在D组，鱼雷胚的雏形已经形成（图2-13），但在N组所做的切片中，只看到了典型的球状胚（图2-14）。37 d切片观察，D组已经形成比较完备的子叶型胚（图2-16），在B组及N组，子叶型胚的发育没有D组完备（图2-15，17）。授粉后47 d时，D组和B组已经看到成熟胚的胚乳（图2-18，19）。N组中没有观察到这一现象（图2-20）。

3 讨论

3.1 荧光观察试验

花粉管荧光观察试验表明，在花粉管抑制物开始作用以前，蜜蜂授粉促进花粉管生长情况好于人工授粉组，随着花粉管的进一步生长，高异质性花粉生长优势明显，达到花柱根部的花粉管数量要多于花粉异质性低的蜜蜂授粉组。结合授粉时柱头花粉数量情况，可以推断D组花粉管到达花柱根部的数量比B组多的原因是由花粉异质性差别引起的。另外，花粉萌发及花粉管生长具有群体效应，D组点授的方式使得大量花粉落到柱头上，也是花粉管长到根部数量较多的原因之一[13]。将蜜蜂授粉应用于大田授粉后，随着蜜蜂采集花粉异质性的提高，授粉效果就会得到改善[14]。这一点在自花授粉组也得到验证，S组由于自交不亲和性导致自花授粉的花在授粉第13天后全部凋落，原因是自花授粉花柱内自交不亲和性基因（S基因）所表达的S-RNase，降解了自花花粉管RNA而抑制了花粉管生长[15]，自花授粉的花粉管在花柱内无法生长，花粉管不能进入胚囊，受精无法完成，致自花授粉不结果。

D组异源花粉强亲和性使花粉管生长到达花柱根部的数量较多。B组蜜蜂的授粉时间为1 d，但在花粉柱头萌发数量、花粉管未受抑制前花粉管的生长上占绝对优势，由于蜜蜂授粉组试验授粉树配置的制约，花粉异质性不足使得大部分生长至花柱中部的花粉管受到抑制，不能到达花柱根部，如果将蜜蜂授粉应用于大田或设施作物授粉，随着采集花粉异质性的提高，这一问题就会得到解决，授粉效果会得到提高[16-17]。综合花粉管生长、花粉柱头萌发2个试验，蜜蜂授粉组表现出柱头花粉萌发数量多，花粉管生长较人工授粉组好，蜜蜂授粉效果完全可以取代人工授粉，特别是在授粉树配置合理情况下，授粉效果会得到有效提升[18]。

3.2 胚、胚乳切片试验

苹果是双受精植物，受精过程中一个生殖核与卵细胞结合，发育成受精胚；另一个生殖核则与2个助细胞结合，发育成为半透明状的胚乳，作为幼胚发育时的养分，随着子叶的生长而逐渐消失。苹果胚珠类型是直立胚珠，胚状体不同发育时期在形态学上经历原胚、球状胚、心形胚、子叶型胚和成熟胚等不同发育阶段。

切片较好反映了胚、胚乳的发育过程，对蜜蜂授粉组、人工授粉组、自然授粉及自花授粉的比较得出，授粉后 2，4，6，10，24 h 切片，椭圆形胚囊保持完整，各个组之间的发育差别不明显。授粉后48，72 h时，珠心细胞解体，D组的解体程度明显大于B组和N组，在S组中没有观察到解体。授粉后13 d，D组水样状的胚乳在消失的程度上大于其他2组，说明发育快于其他2组。S组的子房没有得到受精后生长发育的刺激，花部大部分掉落[19]。

17 d的切片观察到B，D组的受精合子，没有在N组中看到这一现象，说明N组发育滞后。授粉后23 d N组观察到了棒状胚，B组和D组受精卵开始分裂成小球，此时N组发育较快，是由于被观察到的这个样本授粉较早所致。B，D，N组之间差别最大的是在授粉后30 d，D组已经形成了典型的心形胚，而B组心形胚的发育才刚开始，N组只观察到球形胚。37 d切片观察，D组发育成子叶型胚，B，N组发育没有D组完备。47 d时B组和D组已经看到成熟胚，N组只观察到子叶型胚。

B组在胚、胚乳发育速度上相对D组较慢，这是异源花粉强亲和性导致的结果，对比N组的自然授粉，B组还是具有明显的优势，说明蜜蜂授粉的花粉亲和性比自然授粉组的要强。在23 d时N组的胚发育明显快于D组和B组，原因是自然授粉中也存在授粉效果较好的现象，但在其他时间段内，N组发育要比其他2组明显落后。

4 结论

采用蜜蜂授粉，保证了充足的柱头花粉萌发数量，花粉管生长，胚、胚乳能充分、快速发育，并结合蜜蜂授粉成本低，无农药、激素污染等优势，是苹果无公害生产必须的技术措施之一，使其完全可取代人工授粉[20-21]。另外，蜜蜂授粉在胚、胚乳发育速度上存在的优势，证明蜜蜂授粉对花部生长发育起到了促进作用，其中深层次的原因有待进一步研究。