HPLC同时测定复方苦参肠炎康片中4种有效成分含量

闫 研，秦 斌，王铁杰，殷 果

（深圳市药品检验研究院 深圳药品质量标准研究重点实验室，广东 深圳 518057）

复方苦参肠炎康片是由苦参、黄连、黄芩、白芍、车前子、金银花、甘草、颠茄流浸膏制成的中药复方制剂。具有清热、燥湿、止泻的功能，可用于湿热泄泻、症见泄泻急迫或泻而不爽、肛门灼热、腹痛、小便短赤和急性肠胃炎等疾病的治疗，在2015版中国药典中以苦参碱和氧化苦参碱为含量测定成分[1]。对于方中同样发挥重要疗效的有效成分黄芩苷、盐酸小檗碱、芍药苷和甘草酸的含量并未作出标准规定，因此难以全面控制其内在质量。目前，对于芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸中单一或3种成分的高效液相色谱（HPLC）含量测定方法已有报道[2-6]，但同时测定4种成分的HPLC含量测定方法尚未见报道。本文建立了同时测定复方苦参肠炎康片中芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸含量的HPLC方法。该方法操作简便、快速，专属性好，对于复方苦参肠炎康片的质量控制有重要的补充意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪,包括LC-20AD高压泵、LC solution 色谱工作站、SIL-20A自动进样器、SPDM20A紫外检测器、CTO-10Asvp柱温箱、CBM-20A控制箱（日本岛津公司)；XS204分析天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 试药

黄芩苷对照品( 批号：110715-201318，纯度：93.3 %)，盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201212，纯度：86.7 %） ，芍药苷对照品 ( 批号：110736-201539，纯度：96.4 %)，甘草酸铵对照品（批号：110731-201418，纯度：93.1 %）均购于中国食品药品检定研究院；复方苦参肠炎康片 (通化东宝药业，批号：150602，规格：0.4 g/片)；乙腈为色谱纯（德国Merk公司），甲醇、乙醇、磷酸均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液制备 精密称取减压干燥至恒重的芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸对照品各适量，加甲醇分别制成芍药苷1.8 mg/ml、黄芩苷3.0 mg/ml、盐酸小檗碱2.4 mg/ml和甘草酸0.3 mg/ml的对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液各2.0 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇至刻度，混合均匀，即得含芍药苷0.36 mg/ml、黄芩苷 0.6 mg/ml、盐酸小檗碱 0.48 mg/ml、甘草酸0.06 mg/ml的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取样品适量，置研钵中研细，取粉末约1.0 g，精密称定，置入50 ml量瓶，加75 %乙醇适量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放至室温，加乙醇稀释至刻度，摇匀，静置 10 min，取上清，0.45 μm 微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液制备 按处方比例和制备工艺，取缺少黄芩提取物、黄连提取物、芍药提取物和甘草提取物的其他中药材，按2.1.2项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.2 %磷酸，按表1进行梯度洗脱；流速1.0 ml/min；检测波长245 nm，柱温30 ℃，进样量10 μl。

表1 梯度洗脱程序

取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按上述色谱条件进样测定，混合对照品溶液色谱图中芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸的分离度＞1.5，理论板数以芍药苷峰计算不低于6000；阴性对照溶液对4 个测定组分无干扰，见图1。

图1 对照品混合溶液、供试品溶液及阴性对照溶液的HPLC图谱

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密量取2.1.1项下对照品储备液适量，分别置入10 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成不同浓度的系列混合对照品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（x，mg/ml）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表2。结果表明，芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸的质量浓度与峰面积线性关系良好。

表2 回归方程与线性范围

2.3.2 精密度试验 取同一混合对照品溶液，按2.2项下色谱条件，连续自动进样 6次，记录峰面积。结果，芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸峰面积的RSD分别为为1.22 %，1.12 %，1.25 %和1.68 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 精密量取同一供试品溶液适量，分别于室温放置0，2，4，8，12，24 h，按2.2项色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸峰面积的RSD分别为0.68 %，0.63 %，1.35 %和0.54 %（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品适量，精明称定，按2.1.2项方法平行制备6份供试品溶液，按2.2项色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分含量。结果，芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸含量的RSD分别为1.66 %，1.75 %，1.84 %和1.70 %（n=6），表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取已知含量的样品6份，每份约0.1 g，精密称定，平行分组，每组3份，每组记一个平均值，分别按相当于样品中各组分含量的80 %，100 %，120 % 加入2.1.1项下对照品储备液，按2.1.2项方法制备供试品溶液，按2.2项色谱条件测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草酸的平均回收率（n=6）分别为102.8 %，99.9 %，101.8 %和97.7 %，RSD分别为0.48 %，1.99 %，1.59 %和0.80 %。

2.4 样品测定

按2.1.2项方法制备3份供试品溶液，按2.2项色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

本试验在制备供试品溶液时，对提取溶剂[含1 %盐酸的甲醇-水（50:50）、甲醇、75 %乙醇）]进行了考察，综合考虑试验效果等因素，最终确定本试验提取溶剂为75 %乙醇。

3.2 检测波长的选择

本试验同时测定了4个成分，但最大吸收波长各不相同，黄芩苷和盐酸小檗碱在245，275 nm处均有较大吸收，芍药苷、甘草酸分别在240，245 nm处有最大吸收。分别提取这3个波长处的色谱图，结果发现4种成分均在245 nm波长处有较强吸收，且杂质峰干扰较少，因此选择245 nm为检测波长。

3.3 流动相的选择

研究中分别以乙腈（A）-0.5 %三乙胺水溶液（B）（用磷酸调节pH为3.0）和乙腈（A）-0.2 %磷酸水溶液（B）为流动相，采用梯度洗脱。以乙腈（A）-0.5 %三乙胺水溶液（B）（用磷酸调节pH为3.0）为流动相时，基线漂移较大，分离效果不理想。选择乙腈（A）-0.2 %磷酸水溶液（B）为流动相，各组分分离效果好，基线稳定。

3.4 色谱柱的选择

预实验中分别采用了Capcell PAK C18MGⅡ柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），发现Capcell PAK C18MGⅡ柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离效果不太理想，Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离效果好，故选用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱。