金刚藤总黄酮分离纯化工艺研究

况成裕，殷成强，刘大勇，龙玉波，王 振，王 芳，王玉环

（1. 山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室，山东 济南 250101；2. 山东明仁福瑞达制药股份有限公司，山东 济南 250104）

金刚藤为百合科植物菝葜（Smilax chinaL.），又名金刚刺、假萆解[1]，广泛分布于长江以南丘陵地区，药用其根茎。其性甘温无毒，有清热解毒、消肿散结之功效。现代药理学研究表明，金刚藤有抗感染与镇痛[2]、抗肿瘤作用[3]、活血和增强免疫作用[4]。现代临床研究表明，金刚藤在治疗输卵管梗阻性不孕[5]、继发性不孕症[6]、慢性盆腔炎[7]等方面有较好疗效。

国内外学者在金刚藤属植物的生物活性及化学成分研究中取得一定成果[8-9]，研究表明，金刚藤中含有山萘酚、山萘酚-7-O-β-D-吡喃葡糖苷、二氢山萘酚、槲皮素-3-O-葡糖苷、槲皮素、异鼠李素、落新妇苷、新异落新妇苷、槲皮素3-O-α-L-鼠李糖苷、黄杞苷等多种黄酮类化合物。其中落新妇苷含量较高，且生物活性较强，具有心血管活性、免疫抑制、减轻肾功能损伤、保肝等作用[10-12]。

黄酮化合物生物活性众多，经提取纯化，可充分发挥其在医药方面的作用。而金刚藤总黄酮的分离纯化尚未见报道。本实验筛选6种不同型号的大孔吸附树脂纯化金刚藤黄酮，并通过动态实验优化LS-303型大孔树脂纯化工艺，为寻找该植物有效成分，更好地开发利用其资源提供参考。

1 仪器和材料

1.1 仪器

8453型紫外-可见分光光度仪（Agilent），旋转蒸发仪（EYELAOSB0-2100），玻璃层析柱（直径1.5，2，2.5 cm）。

1.2 试药与试剂

金刚藤药材，2015年8～9月采集于贵州开阳县、修文县和四川安岳县，经鉴定为百合科植物菝葜（Smilax chinaL.）的根茎，洗净，切片，晒干；落新妇苷对照品（自制，含量97.82 %），甲醇、乙醇为分析纯，水为纯化水；大孔吸附树脂LS-46D、LSA-40、LS-300B、LS303、D101、AB-8（陕西蓝深特种树脂公司）。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定方法

2.1.1 对照品溶液制备 称取干燥至恒重的落新妇苷对照品（含量97.82 %）5 mg，精密称定（5.09 mg），置入50 ml量瓶，加乙醇20 ml，超声使溶解，加乙醇至刻度，摇匀，制成浓度为0.0996 mg/ml对照品溶液[13]。

2.1.2 供试品溶液制备 药材供试品溶液：称取金刚藤细粉（过40目筛）0.3 g，精密称定，置入250 ml圆底烧瓶，加乙醇100 ml，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，加乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为药材供试品溶液。

浸膏供试品溶液的制备：称取金刚藤药材500 g，加水5 kg，加热回流提取2次，每次时间1.5 h，合并提取液，滤过，浓缩至500 ml，放冷，边搅拌边加入95 %乙醇1400 ml，继续电动搅拌15 min，静置24 h，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至约250 ml，放冷，得浸膏。称取浸膏0.1 g，精密称定，置入100 ml量瓶，加乙醇40 ml，超声30 min，放冷，加乙醇至刻度，摇匀，7000 r/min离心10 min，取上清液作为浸膏供试品溶液。

上样药液、吸附后滤液、洗脱液（见2.3、2.4、2.8项下制备所得）供试品溶液的制备：称取上样药液0.2 g、吸附后滤液0.5 ml、洗脱液供试品溶液0.5 ml，精密称定，分别置入100 ml量瓶，加乙醇40 ml，超声30 min，放冷，加乙醇至刻度，摇匀，7000 r/min离心10 min，分别取上清液作为供试品溶液。

总黄酮提取物供试品溶液：称取总黄酮提取物细粉25 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，加乙醇40 ml，超声30 min，放冷，加乙醇至刻度，摇匀，7000 r/min离心10 min，取上清液作为总黄酮提取物供试品溶液。

2.1.3 检测波长选择 精密量取对照品溶液、药材供试品溶液和总黄酮提取物供试品溶液各1 mL，置入10 mL量瓶，加乙醇至刻度，摇匀，以乙醇为空白，在波长200～400 nm范围内扫描，对照品溶液、药材供试品溶液和总黄酮提取物供试品溶液均在292 nm处有最大吸收峰，因此选择292 nm作为检测波长。

2.1.4 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 ml，分别置入10 ml量瓶，292 nm处测定吸光度，以浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=31.69C+0.053，R2=0.9993。结果表明，落新妇苷在3.98～23.90 μg/ml浓度范围之内呈良好的线性关系

2.1.5 测定 精密量取供试品溶液1 ml，置入10 ml量瓶，加乙醇至刻度，摇匀，292 nm处测定吸光度，计算总黄酮含量。

2.2 上样药液制备

称取金刚藤药材500 g，加水5 kg，加热回流提取2次，每次时间1.5 h，合并提取液，滤过，浓缩至500 ml，放冷，边搅拌边加入95 %乙醇1400 ml，继续电动搅拌15 min，静置24 h，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至约250 ml，放冷，边搅拌边加入纯化水至相对密度为1.10（20 ℃），2～4 ℃静置24 h，抽滤，即得上样药液（约500 ml）。

2.3 静态吸附法筛选大孔吸附树脂型号

取上样药液5份，每份100 ml，分别置入装有经预处理各种型号树脂20 g的250 ml具塞三角瓶[14-15]，每30 min振摇1次，每次30 s，持续3 h，静置过夜，滤过，取续滤液0.5 ml至10 ml量瓶，加乙醇至刻度，摇匀，于292 nm处测定吸光度，计算吸附率。树脂抽滤至干，用70 %乙醇200 ml解吸，操作同上，滤过，得静态洗脱液，测吸光度，计算解吸率，结果见表1。

由表1可见，吸附率、解吸率相对较高的为LS303，其优势明显，故选择LS303型树脂进一步优化工艺。

表1 不同型号树脂静态吸附率及解析率结果

2.4 静态吸附与动态吸附的比较研究

取上样药液100 ml，按2.3项下方法操作，测定吸附率和解析率。

取上样药液100 ml，加至预处理合格的大孔吸附树脂柱（LS-303，20 g，直径1.5 cm），流速1 BV/h，收集吸附后滤液，搅匀，按2.2项下要求测定总黄酮含量，计算吸附率。加70 %乙醇200 ml至树脂柱，搅匀，洗脱，流速1 BV/h，收集洗脱液，搅匀，按2.2项下要求测定总黄酮含量，计算解析率。结果见表2。由表2可见，动态吸附方式的吸附率高于静态吸附。

表2 大孔吸附树脂静、动态吸附率及解析率结果

2.5 泄露曲线绘制

取预处理树脂20 g（体积28 ml），装柱（直径1.5 cm）。取上样药液（45.33 mg/ml）300 ml，以1 BV/h流速上样。收集流出液，每份28 ml。测定总黄酮含量，以总黄酮含量为考察指标绘制泄漏曲线，结果见图1。

由图1可见，当上样吸附84～112 ml（4 BV）时，开始有泄漏，故暂定吸附终点为总黄酮/树脂=5.14:20。

图1 初步确定吸附终点的泄露曲线

2.6 正交试验优选大孔吸附树脂柱吸附工艺

2.6.1 因素及水平考察 根据单因素探索性试验结果，取树脂20 g（28 ml），选择上样药液浓度、吸附流速、树脂柱高度等3个因素，每个因素选择3个水平，设定因素水平，见表3。

表3 大孔树脂吸附工艺因素水平

2.6.2 取金刚藤药材细粉，按2.2项下要求制备上样药液3批，按L9(34)正交表设计方案分别取80 ml，加至预处理合格的大孔吸附树脂柱，进行吸附，吸附结束后，测定吸附后滤液中总黄酮含量，计算吸附率；取200 ml 70 %乙醇加至树脂柱中，搅拌均匀，排净气泡，进行洗脱，洗脱流度均为1 BV/h，洗脱液浓缩、干燥，测定总黄酮含量，测定结果及方差分析结果见表4。

由表4可见，考虑吸附率最佳工艺均为A3B2C1；考虑提取物总黄酮含量最佳工艺均为A3B2C2。由方差分析可见，树脂柱高径比对吸附率有显著影响，上样药液含量对提取物含量有显著影响。综合考虑耗能等因素，最佳工艺定为A3B2C2，即上样药液浓度45.81 mg/ml、吸附流速1 BV/h、树脂柱径高比8.9:2。

表4 筛选动态吸附参数正交试验结果

2.7 重新确定吸附终点

取预处理树脂20 g（体积28 ml），装柱（直径2 cm）。取上样药液（45.56 mg/ml）200 ml，以1 BV/h流速上样。收集流出液，每份14 ml。以总黄酮质量浓度为考察指标绘制泄漏曲线，结果见图2。

由图2可见，当上样吸附84～98 ml（3.5 BV）时，开始有泄漏，故确定吸附终点为总黄酮:树脂=4.5:20，上样药液:树脂（v/v）=3.5:1。

图2 重新确定吸附终点的泄露曲线

2.8 正交设计优化大孔吸附树脂柱洗脱工艺

2.8.1 因素及水平考察 根据单因素探索性试验结果，选择水洗体积数、洗脱液浓度、洗脱液体积数、洗脱流度等4个因素，每个因素选择3个水平，设定因素水平，见表5。

表5 洗脱工艺正交试验因素水平

2.8.2 取金刚藤药材细粉，按2.2项下要求制备上样药液，按2.6和2.7项下优选最佳工艺进行吸附，按L9(34)正交表设计方案进行洗脱，检测水洗脱液、醇洗脱液含量，计算醇洗脱液解析率。将醇洗脱液回收乙醇、减压浓缩、70 ℃减压干燥，检测总黄酮含量，测定结果及方差分析结果见表6。

表6 筛选洗脱参数正交试验结果

由表6可见，考虑醇洗脱液解析率，最佳工艺为A3B2C2D3；考虑提取物总黄酮含量，最佳工艺为A3B2C2D2。由方差分析可见，水洗体积数、洗脱液浓度对解析率、总黄酮含量有显著影响。综合考虑耗能等因素，最佳工艺定为A2B2C2D2，即水洗体积数2 BV、洗脱液浓度60 %、洗脱液体积数6 BV、洗脱流度1 BV/h。

2.9 干燥温度考察

取上样药液70 ml，按2.3～2.8项下操作得60 %乙醇洗脱液500 ml，减压回收乙醇，平均分为3份，转移至蒸发皿中，减压干燥（60，70，80 ℃）。干燥后，研细，称重，得金刚藤总黄酮提取物。按2.1项下操作测定总黄酮含量，结果见表7。由表7可见，干燥温度对总黄酮含量无明显影响，但60 ℃干燥时间较长，因此确定减压干燥温度为70 ℃。

表7 不同干燥温度对总黄酮含量影响结果

2.10 工艺验证试验

为考察上述工艺的稳定性，按最佳工艺条件重复试验（n=3），分别测定金刚藤总黄酮提取物中总黄酮含量，结果见表8。由表8可见，该工艺稳定、可行。

表8 3批工艺验证结果

2.11 树脂再生使用试验

按照工艺验证试验方法连续10次试验，结果LS303型树脂的重复使用性能较好，重复使用10次之后，吸附率和解析率无明显变化。

3 讨论

3.1 由于工业化生产均使用全自动设备，多为动态吸附，因此本试验采用静态吸附筛选树脂型号后，与动态吸附进行比较研究，发现动态吸附的吸附率高于静态吸附。

3.2 本试验筛选吸附终点为上样药液：树脂（v/v）=3.5:1，在此条件下，仍有少量泄露，为降低损失，扩大生产时可适当降低比例。

3.3 金刚藤吸附结束，树脂柱内仍有部分上样药液，含有较多非黄酮类成分，因此本试验考察了水洗脱体积数，水洗2 BV和3 BV无明显差异，因此选择水洗2 BV。