CNAS T0781药品的无菌检查（薄膜过滤法）能力验证结果与分析

北京市药品检验所 中药成分分析与生物评价北京市重点实验室（102206）江志杰 张光华 刘文杰 高春

能力验证是利用实验室间比对测试来判定实验室和检查机构能力的活动[1]。它是实验室的重要的外部质量保证手段，能增加客户及相关方对实验室出具可靠数据的信心[2]。根据《中国药典》2010年版的要求，对要求无菌的药品必须进行无菌检查，而不同单位的无菌检测能力各不相同或是检验环境的差异，可能会出现同一样品出具不同的结果，因此开展药品无菌检测能力验证来衡量检测实验室结果准确性具有重要意义，也为有效控制无菌药品的结果准确性提供了技术的保障。为评价参加实验室检测药品无菌的技术水平和能力，确定和核查实验室对于本项目的检测能力，提高各参加实验室对该类测试项目的检测水平，促进实验室质量管理体系的进一步完善，因此开展本次能力验证计划。此能力验证属国内首次组织开展，出于保密需要，本次计划对每个参加实验室随机赋予一个唯一的代码(001～084)，在说明与参加实验室有关的检测结果和结果评价时，均以上述代码表示实验室。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备 HFsafe-1500 生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）、生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、XG1高压蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）、HEY-SZ18068无菌隔离器（杭州泰林生物技术设备有限公司）等。

1.2 菌液的制备 根据《中国药典》2015年版1101无菌检查法项下要求制成黑曲霉浓孢子液（含孢子数105cfu/ml），置冰箱储存，备用。取枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]斜面新鲜培养物加0.9%氯化钠溶液将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将悬液吸出至营养琼脂大斜面（克氏瓶）上，均匀摊布，置33℃培养7d，进行革兰氏染色观察，确保芽孢含量在85%以上，用灭菌水50ml少量多次洗下孢子，合并洗液至大试管中，制成浓孢子液（含孢子数105cfu/ml），置冰箱储存，备用。

1.3 能力验证样品的制备 样品为XX药业生产的注射用泮托拉唑钠批号为17030811共1500支，分为300份，每份由A、B、C、D、E 5支样品组成，其中三支样品为无菌的注射用泮托拉唑钠，一支样品人工污染1μl上述细菌（枯草芽孢杆菌）菌液，一支样品人工污染1μl上述真菌（黑曲霉）菌液。

1.4 方法学考察 根据《中国药典》2015年版1101无菌检查法项下要求，以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉为验证菌，进行方法学验证。

1.5 样品稳定性和均匀性考察 按CANSGL03:2006[3]的要求，从样品总体中随机抽取20份样品用于均匀性检验，采用已验证的薄膜过滤法进行无菌检查；不同的温度（4℃、25℃、36℃）不同的时间点（15天、30天、60天）随机取10份采用上述已验证的薄膜过滤法进行无菌检查，考察样品的稳定性。

1.6 结果评价原则 3支无菌样品和2支有菌样品的检验结果均正确，即与预期结果完全一致，判定为满意结果；2支有菌样品中，任意1支检验结果出现错误，或3支无菌样品中，任意1支检验结果错误，即为不满意结果。

2 结果与分析

2.1 方法学验证结果 本品与培养基会形成乳白色沉淀，故采用薄膜过滤法，用0.1%蛋白胨水溶液300ml冲洗一次，与对照管比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好，说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。故确定的检验方法如下：取本品1支，用0.9%氯化钠注射液5ml溶解后，全量转移至0.9%氯化钠注射液100ml中，采用全封闭无菌试验过滤培养器（三联）全部过滤，用0.1%蛋白胨水300ml冲洗1次，每筒冲洗100ml，将胰酪大豆胨液体培养基100ml加入其中一筒，置25℃培养14天；其余两筒均加入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，其中一筒加金黄色葡萄球菌作为阳性对照，置33℃培养14天，逐日观察。

2.2 样品均匀性和稳定性考察结果 从实验结果得知，0时的无菌样品均无菌生长，与已知结果（应无菌生长）一致；有菌样品均有菌生长，与已知结果（应有菌生长）一致；此外，无菌的样品分别在4℃、25℃、36℃不同的时间点取样采用薄膜过滤法进行无菌检查，结果均无菌生长；有菌的样品分别在4℃、25℃、36℃不同的时间点取样采用薄膜过滤法进行无菌检查，结果显示均有菌生长，作为定性样品，符合均匀性和稳定性的要求。

2.3 能力验证结果 本次能力验证共有84家实验室参加，全部提交了检测报告，其中结果不满意有8家，从不满意结果的检查报告中显示，假阳性和假阴性结果均存在，具体结果见附表。

2.4 不满意结果原因分析 通过对实验室提供的检测报告的核查，对可能造成上述8家不满意结果的原因分析如下。

①无菌检查试验环境监控不到位，试验人员无菌操作意识不够强。CNAS T0781-058实验室两支阴性样品均报“检出”，可能是由于该实验室无菌检查环境不符合要求，操作人员的无菌操作意识不够强而导致的。从其原始记录中还发现，该两瓶阴性样品中检出的菌均为革兰氏阳性菌。CNAS T0781-037实验室中的一支阴性样品报“检出”，从其原始记录中发现，所有上报有菌生长的样品均为第一天就生长，而含黑曲霉的阳性样品，至少需要培养48小时以上才能观察到有菌生长，即含黑曲霉的阳性样品第一天生长的菌并非是黑曲霉，而是实验过程中污染的微生物，故分析可能该实验室无菌检查环境不符合要求或操作人员的无菌操作意识不够强所致。建议对检出菌进行鉴定溯源，查找原因。

②培养基的质量不佳导致结果出现偏差。含枯草芽孢杆菌的阳性样品在硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中培养三天后均应生长良好，而CNAS T0781-017实验室和CNAS T0781-062实验室的含枯草芽孢杆菌的阳性样品在改良马丁中未生长，CNAS T0781-008实验室是在第五天才发现有菌生长，可能是该实验室的培养基的质量或灭菌条件不合适导致培养基营养有所下降所致，灵敏度可能不符合药典要求，从而影响枯草芽孢杆菌和黑曲霉在改良马丁培养基中生长速度或检出率。从CNAS T0781-017实验室提供的培养基适用性检查记录中可以发现，营养琼脂接触碟和营养琼脂培养基的回收率最高才80%，有的仅为70.3%，尽管符合药典要求（大于70%），但其灵敏度已有所下降，且培养基开启日期为2013年11月20日，时间较长，可能影响其培养基质量，从而导致检验结果出现偏差。

③试验记录可能有误，结果出现混淆。CNAS T0781-011实验室一支阳性样品B（黑曲霉），上报结果为“未检出”；一支阴性样品D，上报结果为“检出”。通过原始记录分析发现，其报检出的阴性样品D仅改良马丁培养基中有菌生长，且是第三天开始生长，与黑曲霉的生长特性相吻合，是在试验或记录过程中将样品D与样品B混淆所致。

3 结论

CNAS 在CNAS RL02:2011中规定了实验室应将能力验证作为重要的外部质量评价活动，对参加了CNAS 组织及其承认的能力验证活动且有稳定满意表现的机构，在CNAS 的各类评审中可根据情况简化相关项目的能力确认过程[4]。能力验证工作的重要性已得到社会各界的广泛认可，鼓励更多的实验室参加各种能力验证活动，可以提高我国药品检测质量控制整体水平和实验室的技术能力。通过本次能力验证，发现许多实验室从环境、人员、操作SOP、培养基等许多地方需要改进，为避免实验结果出现假阳性和假阴性，笔者建议加强对检验人员的技术培训，熟悉无菌检测的检验方法，严格把握检测过程中的关键控制点和无菌意识；加强对培养基质量的控制，对每一批培养基应进行适用性检查，同时对消毒过程要严格监控，防止消毒不彻底或温度过高等，并做好记录，对放置时间太久已开启的干粉培养基，尽量不要使用，以免影响其质量；对实验过程中的环境进行监控，对环境中收集的菌进行染色、分离、纯化、鉴定，建立实验室的菌种库，将样品中分离的菌与环境中分离的菌进行溯源分析，进行同源性比较，采用多种方法对可疑结果进行判定。

附表 8家不满意实验室上报的具体结果