肺抑瘤合剂质量标准研究*

隋晓丽，张红艳，田晓倩 ，彭召云，李 芳，刘 健，郑 心△

1山东中医药大学第二附属医院，山东 济南 250001；2山东中医药大学

肺抑瘤合剂是山东中医药大学第二附属医院自主研发的口服中药合剂，由党参、黄芪、白花蛇舌草、半枝莲、薏苡仁、浙贝母、夏枯草、甘草等12味中药组成，具有益气养阴，清热解毒，化痰祛瘀的功效。临床主要用于原发性支气管肺癌气阴两虚、痰瘀热毒互结证，症见咳嗽、咳痰或咳痰带血、胸痛、憋喘、发热、乏力、纳呆等症状。根据《医疗机构制剂注册管理办法》相关要求，为有效控制该制剂的质量，保证临床疗效的稳定性，本研究采用薄层色谱法（TLC）对方中黄芪、薏苡仁、浙贝母、甘草4味药进行定性鉴别。黄芪是方中君药，黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，黄芪及制剂中多以黄芪甲苷作为质量控制指标，本研究参考有关文献［1-4］，采用高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法测定肺抑瘤合剂中黄芪甲苷的含量，建立专属性强、稳定可靠的质量控制方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱色谱仪（美国Agilent公司）；Agilent 380-ELSD蒸发光散射检测器（美国Agilent公司）；AB135-S型电子天平（METTLER TOLEDO）；KQ-500E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂 黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110781-201314）；薏苡仁油对照提取物（中国食品药品检定研究院，批号：111750-201102）；薏苡仁对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121254-201203）；贝母素甲对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110750-201311）；贝母素乙对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110751-201110）；浙贝母对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：120972-200404）；甘草苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：13020901）；甘草对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：120904-201318）。乙腈为色谱纯；水为哇哈哈高纯水，其他试剂均为分析纯。肺抑瘤合剂样品及阴性样品（山东中医药大学第二附属医院制剂室自制，批号：20150511，20150513，20150518）。

2 方法与结果

2.1 黄芪的鉴别 取黄芪对照药材2 g，加甲醇20 mL，超声30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL、对照药材溶液10 μL与对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷 - 甲醇 - 水（13∶7∶2）的下层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上日光下显相同颜色的斑点，紫外光下显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，见图1。

图1 黄芪TLC鉴别

2.2 薏苡仁的鉴别 取本品30 mL，取石油醚（60～90℃）30 mL，超声处理 30 分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加石油醚（60～90℃）1 mL使之溶解，作为供试品溶液。取处方中除去薏苡仁药材的其余药材，同法制成缺薏苡仁的阴性对照溶液。另取薏苡仁对照药材 1 g，加石油醚（60～90℃）30 mL，超声处理30分钟，滤过，取滤液，作为对照药材溶液。再取薏苡仁油对照提取物，作为对照提取物溶液。依照TLC法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL、对照药材溶液5 μL与对照提取物溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙醚 - 冰醋酸（83∶17∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图2。

图2 薏苡仁TLC鉴别

2.3 浙贝母的鉴别 取本品25 mL，加浓氨试液5 mL与三氯甲烷25 mL，超声30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。取处方中除去浙贝母药材的其余药材，同法制成缺浙贝母的阴性对照溶液。另取浙贝母对照药材1g，加浓氨试液2 mL与三氯甲烷25 mL，超声30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取贝母素甲对照品、贝母素乙对照品，加三氯甲烷制成每1 mL各含2 mg的混合溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL、对照药材溶液15 μL与对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯 - 甲醇 - 浓氨试液（17∶2∶1）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。结果供试品色谱中在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图3。

2.4 甘草的鉴别 取本品25 mL，加乙醚提取2次，30 mL/次，弃去乙醚液，用正丁醇提取3次，20 mL/次，合并正丁醇液，用水洗涤3次，20 mL/次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。按处方另取去除甘草以外的药材同法制成阴性液。另取甘草对照药材l g，加乙醚40 mL，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30 mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 mL使溶解，自“用正丁醇提取3次”起，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品，加甲醇制成每l mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷 - 甲醇 - 水（13∶7∶2）的下层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光（365 nm）下检视。结果供试品色谱中在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色斑点，紫外光下显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，见图4。

图3 浙贝母TLC鉴别

图4 甘草TLC鉴别

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈 - 水（32∶68），流速1.0 mL/min，柱温25℃，ELSD参数：漂移管温度90℃，雾化温度40℃，载气流速为1.20 L/min。理论塔板数按黄芪甲苷计算不低于4 000。

2.5.2 供试品溶液的制备 取肺抑瘤合剂样品（批号：20150511），摇匀，精密量取 20 mL，用水饱和正丁醇振摇提取4次，40 mL/次，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，40 mL/次，弃去氨液，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.5.3 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.458 0 mg的溶液，即得。

2.5.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例，不加黄芪药材，按本品制备工艺制得缺黄芪阴性样品，再按“2.5.3”项下方法制备缺黄芪的阴性对照溶液。2.5.5 专属性试验 精密吸取对照品溶液10 μL，供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果对照品和供试品有相同保留时间的色谱峰，阴性对照在此保留时间无色谱峰，表明在该色谱条件下阴性对照溶液对黄芪甲苷含量测定无干扰，见图5—7。

图5 黄芪甲苷对照品

图6 肺抑瘤合剂样品

图7 阴性对照样品

2.5.6 线性关系考察 取黄芪甲苷对照品溶液（0.4580 mg/mL），按“2.5.1”项下色谱条件，分别进样 2，4，8，10，15，20 μL，测得峰面积，计算进样量和峰面积的对数，绘制回归方程。回归方程：lgY=1.418lgX+2.480，r=0.999 5，结果表明，黄芪甲苷进样量在0.916 0～9.160 0 μg范围内线性关系良好。

2.5.7 精密度试验 取黄芪甲苷对照品溶液（0.422 0 mg/mL），按“2.5.1”项下色谱条件，进样10 μL，连续进样6次，测得峰面积值，结果峰面积RSD为1.97%，表明仪器精密度良好。

2.5.8 重复性试验 取肺抑瘤合剂样品（批号：20150511），摇匀，精密量取 20 mL，称取 6 份，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，结果其含量平均值为21.74 μg/mL，RSD为1.47%，表明该方法重复性良好。

2.5.9 稳定性试验 取肺抑瘤合剂样品（批号：20150511），摇匀，精密量取 20 mL，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，分别于放置后的0，2，4，8，12，16小时测定。结果表明供试品溶液在16小时内基本稳定，黄芪甲苷峰面积RSD为1.90%。

2.5.10 加样回收率试验 取肺抑瘤合剂样品（批号：20150511，黄芪甲苷含量 21.74 μg/mL），摇匀，精密量取20 mL，称取6份，分别精密加入黄芪甲苷对照品水溶液（0.549 8 mg/mL）1 mL，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，测定，计算得加样平均回收率为96.99%，RSD为0.96%。

2.5.11 黄芪甲苷含量测定 取3批肺抑瘤合剂，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，测定，结果见表 1。

表1 3批样品中黄芪甲苷的含量

3 讨论

3.1 TLC鉴别 本研究对肺抑瘤合剂中黄芪、薏苡仁、浙贝母、甘草4味药材的TLC鉴别条件进行考察和优化。参照《中国药典》（2015年版）［5］，在薄层鉴别中，黄芪测定的是黄芪甲苷和黄芪对照药材，薏苡仁测定的是薏苡仁油对照提取物，浙贝母测定的是贝母素甲、贝母素乙，甘草测定的是甘草酸单铵盐和甘草对照药材，上述4味药材有明确的测定成分，因此在选用对应的对照品溶液的基础上同时选用对照药材。

在参照《中国药典》2015年版鉴别方法的基础上，经过试验与调整，确定黄芪、薏苡仁和浙贝母的鉴别方法。甘草选用的是甘草苷对照品，并对其展开系统进行考察，结果采用乙酸乙酯-甲酸- 冰醋酸 - 水（15∶1∶1∶2）为展开剂；考察了10 cm 和20 cm的薄层板，供试品斑点的分离度均不好。采用三氯甲烷 - 甲醇 - 水（13∶7∶2）的下层为展开剂，供试品斑点清晰、分离度好。最终确定以三氯甲烷- 甲醇 - 水（13∶7∶2）的下层为展开剂。

3.2 含量测定

3.2.1 指标成分的选择 本制剂由党参、黄芪等12味药材经提取、浓缩、加工成液体制剂。黄芪为方中君药，其所含的成分主要为黄芪甲苷等皂苷类成分及毛蕊异黄酮等黄酮类成分，黄芪甲苷含量高、性质稳定，且文献中应用黄芪甲苷作为黄芪药材含量测定成分的报道居多，方中白花蛇舌草等含有大量黄酮类成分，导致毛蕊异黄酮干扰严重，杂质较多，且毛蕊异黄酮对照品较难获得，故本研究用高效液相法定量样品中的黄芪甲苷含量。

3.2.2 测定方法的选择 由于黄芪甲苷在紫外区为末端吸收，信号较弱，其他杂质干扰大，很难达到基线分离［6］，蒸发光散射检测器为通用型检测器，对皂苷类等紫外末端吸收的物质响应较好。因此本研究选择HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷。

3.2.3 流动相的选择 曾采用A乙腈-水（35∶65）、B 乙腈 - 水（25∶75）、C 乙腈 - 水（32∶68）作为流动相，考察出峰时间和色谱分离情况，结果流动相A出峰时间过早，谱图出现杂质峰较多，样品中的其他成分对黄芪甲苷峰的干扰明显；流动相B出峰时间过晚，超过20分钟，分析时间长，溶剂用量大；而流动相C的出峰时间为16分钟左右，各成分分离情况较好，所测得黄芪甲苷峰形良好。综合考虑选择乙腈-水（32∶68）作为本研究的流动相。

3.2.4 ELSD检测器参数的考察 本研究对漂移管温度、雾化温度和载气流速进行考察，结果漂移管温度90℃，雾化器温度40℃时，黄芪甲苷有较低的信噪比和较高的信号响应值，可获得最大的检测灵敏度，且载气流速对峰保留时间、峰形均有一定影响，流速越大，响应值越小，综合各因素，经多次试验，确定了漂移管温度为90℃，雾化器温度40℃，载气流速为1.20 L/min。

综上所述，所建立的质量控制方法准确可靠，可用于肺抑瘤合剂的质量控制。