髓芯减压联合生骨再造丸对兔激素性股骨头坏死骨组织BMP-2与VEGF mRNA的影响*

魏玉娇，何 玲，郭小荣，曹林忠 ，张虎林 ，张晓刚，郭成龙△

1甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020；2甘肃中医药大学

激素性股骨头坏死是使用激素最严重的并发症之一，发病率高、致残率高，临床治疗手段有限，给患者心理、经济带来压力［1］。前期临床研究发现，髓芯减压联合生骨再造丸对早期激素性股骨头坏死疗效明显［2］。本研究通过观察骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因表达的变化，进一步探讨生骨再造丸对激素性股骨头坏死的防治机理。

1 材料与方法

1.1 动物 健康成年雄性青紫蓝兔60只，体质量（2.0±0.20）kg，清洁等级二级，由甘肃省生物制品研究所实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK（甘）2015-0001，标准颗粒饲料喂养。

1.2 药物 生骨再造丸由黄芪、淫羊藿、骨碎补、血竭、三七等药物组成（甘肃中医药大学附属医院纯中药制剂，批号：151207）；大肠杆菌内毒素（LPS，美国Sigma公司，进口药品注册证号：H20040139，批号：LL0411，规格：25 mg/ 瓶）；甲强龙（美国辉瑞生物制药公司，批号：F4088306）；青霉素（80万U，哈药集团制药总厂，批号：F40088305）。

1.3 试剂 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、多聚甲醛、戊巴比妥钠、乙二胺四乙酸二钠由兰州军区兰州总医院骨研所提供，均购自天津华生试剂有限公司。

1.4 仪器 ZT-12J1型生物组织自动脱水机（湖北孝感市亚光医用电子技术研究所）；OLYMPUS VANOX型自动光学显微镜（JAPAN）；OLYMPUS型生化仪（日本，LC-005）；202-ZAB型电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；总RNA提取试剂盒Ⅱ（美国 OMEGA 公司，批号：R6934）；TIANScript cDNA型第一链合成试剂盒（天根生化科技有限公司，批号：RT120420）；PCR 引物合成（上海捷瑞生物工程有限公司）；2×Taq PCR Master Mix 型（天根生化科技有限公司，批号：KT201-02）；50bp DNA Ladder Marker（北京博凌科为生物科技有限公司，批号：M07-01）。

1.5 方法

1.5.1 动物分组 60只青紫兰兔适应性喂养1周后，按随机数字表法分为5组，即N组：正常对照组（8只）；Y组：模型对照组，M组：生骨再造丸组，S组：手术组，SM组：综合治疗组，每组13只。

1.5.2 动物造模 兔子耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素（LPS，Sigma 公司产品）50 μg/kg 共 2 次，每次间隔24小时，最后1次注射LPS后臀肌注射甲基强的松龙（MP，20 mg/kg）共3次，每次间隔24小时。4周后模型成立。

1.5.3 给药及饲养 模型成立后第2天开始灌胃，灌胃剂量按照人与家兔体表面积折算的等效剂量比例换算，生骨再造丸配制成每毫升所含生药相当于3 g原药材的浓缩液，M组、SM组给药剂量4.6 mL/（kg·d），连续灌胃 8周。N 组和 Y 组予等量［4.6 mL/（kg·d）］生理盐水连续灌胃 8周。单笼标准兔子颗粒饲料喂养（兰州军区兰州总医院动物实验中心提供），自由饮水。饲养室保持良好通风，控制室温在（22±1）℃，光照与黑暗时间为每12小时交替。

1.5.4 手术方法 手术组采用髓芯减压术治疗。动物俯卧于手术台上，局部备皮后消毒，沿大转子切开皮肤、皮下，分离肌肉及骨膜，在大转子上用2 mm细钻头向股骨头内钻孔，以不越过股骨头软骨面为界。彻底清除髓腔后关闭切口，术后肌内注射青霉素10万U以预防感染，1次/d，共1周。

1.5.5 取材与处理 第11周采用静脉推注空气法处死家兔，观察大体标本。然后完整无损地切取双侧股骨头，将双侧股骨头沿正中冠状面剖开，4%多聚甲醛液固定，10%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）脱钙，系列酒精脱水，常规石蜡包埋、切片、HE染色。光镜下观察骨小梁、骨细胞、髓腔脂肪细胞变化，计数空骨陷窝，计算空骨陷窝率。

1.5.6 BM P-2与V EG F m RN A表达的检测 清除股骨头表面组织，沿基底部将股骨头锯下后沿矢状面剖开，取骨组织50 mg，按试剂盒说明书提取总RNA，用微量核酸蛋白分析仪计算所提RNA含量和纯度。取总RNA 2μg，按逆转录试剂盒说明书逆转录合成第一链 cDNA，β-actin 上游引物：5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′，下游引物：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′；BMP-2 上游引物：5′-GTCCTGAGCGAGTTCGAGTT-3′，下游引物：5′-TGAAGCTCTGCTGAGGTCAT-3′；VEGF 上游引物：5′-AGGAGACAATAAACCCCACG-3′，下游引物：5′-CACACTCCAGGCTTTCATCAT-3′。

β-actin、BMP-2、VEGF 的 PCR 扩增产物大小分别为：375bp、308bp、187bp。PCR 扩增条件（25 μL体系）：94℃预变性2分钟；95℃变性30 s，退火温度30 s（β-actin 55℃、TGF-β154℃、CTGF 56℃）72℃延伸30 s，共35个循环；72℃再延伸5分钟，4℃冷却5分钟。对PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像系统测定灰度值，以β-actin mRNA表达作为内参照，以BMP-2 mRNA和VEGF mRNA值与β-actin mRNA的灰度比值表示mRNA相对表达水平。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0软件分析数据，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析；计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察 N组动物精神饮食活动正常，无死亡。造模各组在臀肌注射甲基强的松龙（MP）后出现精神萎靡、反应迟钝、皮毛失去光泽、体毛干枯脱落、皮下脂肪减少、大便溏薄等表现。至第3周时上述表现逐渐消失，动物体质量无明显变化，精神状态及活动良好。

2.2 股骨头标本观察 各组股骨头标本外形大体正常，关节软骨变薄、略苍白色，未见明显软骨剥脱或股骨头塌陷。HE染色Y组骨小梁排列散乱、稀疏、部分骨小梁萎缩、断裂，周围无成骨细胞，骨髓内造血细胞和脂肪细胞坏死，骨髓腔扩大。M组骨髓内血管扩张，骨小梁稍细，结构基本完整，骨小梁周围偶见少量成骨细胞，空骨陷窝较Y组减少，脂肪细胞较多，造血细胞较多，骨髓细胞分布不均匀。S组骨小梁变细，结构基本完整，形态不规则、骨髓内大面积造血细胞和脂肪细胞坏死，坏死周围可见炎性细胞浸润及纤维组织增生。SM组骨小梁粗大、结构基本完整，骨小梁周围可见大量成排骨母细胞，脂肪细胞少，软骨下骨细胞饱满、空陷窝少，可见大量造血细胞，骨髓细胞分布均匀。M组、S组、SM组骨小梁较Y组密集，脂肪细胞逐次减少，造血细胞增多，有利于骨坏死的修复，其中S组和SM组尤为明显。与Y组比较，各治疗组空陷窝率均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），以MS组降低最为显著（P＜0.01），见图1—4及表1。

图1 模型对照组（Y组，×400）

图2 生骨再造丸组（M组，×400）

图3 手术组（S组，×400）

图4 综合治疗组（SM组，×400）

表1 各组家兔股骨头空陷窝率比较（±s） %

表1 各组家兔股骨头空陷窝率比较（±s） %

注：与模型对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

组别 只数 空陷窝率模型对照组 12 24.34±3.52生骨再造丸组 12 17.32±2.51*手术组 12 19.68±1.75*综合治疗组 12 14.30±2.06**

2.3 各组兔股骨头骨组织中BM P-2及V EG Fm RN A表达 与Y组比较，各治疗组BMP-2和VEGF mRNA表达升高，其中M及MS组比较差异有统计学意义（P＜0.05），以MS组BMP-2及 VEGFmRNA水平升高最为显著（P＜0.01），见表 2。

表2各组家兔BM P-2与V EG F m RN A表达比较（±s）

表2各组家兔BM P-2与V EG F m RN A表达比较（±s）

注：与模型对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

组别 只数 BM P-2 V EG F模型对照组 12 0.22±0.02 0.36±0.04生骨再造丸组 12 0.42±0.05** 0.58±0.04*手术组 12 0.28±0.05 0.44±0.07综合治疗组 12 0.49±0.06** 0.76±0.08**

3 讨论

激素性股骨头坏死是一种应用激素后造成的以无菌性骨坏死为特征的疾病，是无创性股骨头坏死的首要原因，然而，目前针对激素性股骨头坏死的现有临床治疗方案收效甚微［3］。激素性股骨头坏死属祖国医学“骨蚀”“痹症”“骨痹”“髋骨痹”“骨蒌”等范畴［4］。该病的发生与先天不足、后天失养、外伤等因素密切相关［5］。临床对该病的认识虽各有侧重，但不外乎虚、痰、瘀3个方面，故中医药对该病的治疗以补肾、健脾、活血化瘀为基本思路［6］。由于该病晚期致残率较高，因此越发重视该病的前期保守治疗。在骨生长及修复期，骨的形成主要依靠骨的血管来启动和完成［7］。临床大剂量应用激素后引起血管损伤，股骨头血供中断，从而引起缺血坏死，故改善股骨头血供、促进股骨头内血管再生是防治激素性股骨头坏死的关键［8］。研究证实［9-10］，BMP-2、VEGF 等细胞因子参与了激素性股骨头缺血坏死的病理生理过程，该病的发生与BMP-2、VEGF表达异常密切相关。BMP-2是一类具有促进软骨细胞增殖与分化、促进毛细血管内皮细胞增殖功能的细胞生长因子，对血液循环重建具有重要作用［11］；VEGF作为调控血管生成的重要细胞因子，其促进微血管形成作用对股骨头坏死的病理演变及坏死修复起重要作用，VEGF可通过调节软骨内成骨的微血管生成而参与骨形成［12］。

生骨再造丸是甘肃省名中医张晓刚教授的经验方，有补肝益肾、益气活血、通阳利湿的功效。方中淫羊藿、鹿角胶、骨碎补等补肝肾，强筋骨；黄芪补益脾肺之气，配合丹参、三七、血竭、山楂等行气活血化瘀，促进气血运行。前期实验发现生骨再造散可缩短骨折愈合过程所需时间，提高骨折愈合质量［13］，还可明显降低家兔血浆黏度、全血黏度和红细胞压积，认为生骨再造散防止激素性股骨头坏死的发生和发展的机理可能与其对血液流变学的调节作用有关［14］。髓芯减压术作为治疗股骨头缺血性坏死的一种方法已有30余年历史。其通过降低骨内高压，排出坏死组织，刺激加压孔周围的血管形成，增强坏死骨的爬行替代，使坏死灶得以消除［15］。本研究中髓芯减压术在一定程度上降低了股骨头坏死的发生率，但是作用有限，联合生骨再造丸能改善股骨头血液循环，有效增加股骨头骨密度，提高骨强度，阻止股骨头变形，较单一采用髓芯减压术效果明显。

本研究通过观察实验动物组织病理学及骨组织BMP-2及VEGF mRNA的表达发现，生骨再造丸能够有效促进家兔股骨头坏死部位骨组织沉积，减少空陷窝率，并上调BMP-2及VEGF mRNA在骨组织中的表达。提示生骨再造丸可能通过提高BMP-2及VEGF表达，促进股骨头血管新生和改善其血液循环从而起到防治激素性股骨头坏死的作用，为临床治疗该病提供了新的理论依据。