紫草素对荷肝癌大鼠免疫功能的影响*

赵 阳

邯郸市中心医院免疫科，河北 邯郸 056001

肝癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，其致死率居恶性肿瘤第二位，严重威胁人类生命健康。病理生理学研究［1-2］发现肿瘤患者多处于免疫系统抑制、免疫活性细胞功能低下状态，从而使肿瘤细胞易于生长和转移，因此以改善患者免疫功能为切入点可能是研发高效、低毒新型抗肿瘤药物的新思路。紫草素是中药紫草的主要活性成分，具有抗炎、增强机体免疫功能等生物学活性［3-4］。本研究通过腋窝皮下注射接种肝癌Walker-256细胞的方法建立荷肝癌大鼠模型并给予不同浓度紫草素干预治疗，探讨紫草素对荷肝癌大鼠免疫功能的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞 清洁级雄性Wistar成年大鼠和Wistar大鼠幼鼠购自河北省实验动物中心，动物许可证号：SCXK（冀）2013-1-003；肝癌Walker-256细胞株购自上海医药工业研究院。

1.2 药物与试剂 紫草素[中国药品生物制品检定所（纯度≥98%]；注射用顺铂（山东齐鲁制药有限公司）；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司）；噻唑蓝（MTT，Sigma 公司）；白细胞介素 2（IL-2）、肿瘤坏死因子α （TNF-α）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；苏木精-君红（HE）染色试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的制备、分组与给药 荷肝癌大鼠模型的制备：实验用人肝癌HepG2细胞株常规解冻复苏后植入DMEM高糖培养基，置于细胞培养箱培养，取对数生长期细胞经0.25%胰酶消化并调整浓度为4×106个/mL，无菌条件下注射接种于Wistar大鼠幼鼠腹腔，1周后抽取癌性腹水1 mL注射接种于Wistar成年大鼠右腋窝皮下，1周后出现大小约1 cm×1 cm×1 cm瘤体即可判定造模成功。取100只模型大鼠随机分为模型组、紫草素［40、20、10 mg/（kg·d）］组和顺铂［2 mg/（kg·d）］组，各20只，分别给予相应药物进行干预，模型组同步给予等体积生理盐水，疗程14天。

1.3.2 各组大鼠瘤体生长状况 观察各组大鼠瘤体特征，包括瘤体大小、活动度、硬度等。

1.3.3 抑瘤率的计算 颈椎脱臼处死动物后剥取肿瘤组织并称重。

1.3.4 肿瘤组织形态结构 取称重后瘤体，置于4%多聚甲醛溶液中进行固定、石蜡包埋、切片和脱蜡水化处理后，行常规HE染色和复染，采用显微镜观察并照相保存。

1.3.5 脾淋巴细胞转化率 颈椎脱臼处死动物后开腹取脾脏组织，研磨匀浆后经200目筛过滤，离心取细胞，加入10 mL NH4Cl，37℃水浴10分钟，将细胞悬浮于培养液（2 mL）并调整细胞浓度为2×106/mL；各组细胞均接种于96孔板，设6个复孔｛3个实验孔［滴加100μL植物血凝素（PHA）液］、3个对照孔（滴加 100 μL 培养液）｝；37℃、5%CO2培养48 小时后每孔加入 20 μLMTT 溶液（5 mg/mL），继续培养4小时后去上清，加入二甲基亚砜（DMSO）200 μL，10分钟后由酶标仪测定波长490 nm处吸光度（OD）值，以刺激指数（SI）反映脾淋巴细胞转化率：SI=PHA刺激孔OD/对照孔OD。

1.3.6 血清IL-2、TN F-α含量 麻醉后开腹并经腹主动脉取血，1 500 rpm离心10分钟，取血清，通过酶标仪测定各组大鼠血清中IL-2、TNF-α含量。1.3.7 血液CD 4+、CD 8+百分率的测定及CD 4+/CD 8+比值的计算 麻醉后开腹并经腹主动脉取血，10 000 rpm离心5分钟，取细胞，经磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤后滴加70%乙醇5 mL，4℃环境放置48小时后离心去除乙醇，约1 mL PBS溶液打散细胞团后加水解酶5μL（10mg/mL），37℃放置 1小时后加入碘化丙啶100 μg/mL，避光孵育30分钟后通过流式细胞仪检测CD4+、CD8+百分率并计算CD4+/CD8+比值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 15.0软件分析数据，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素对荷肝癌大鼠瘤体特征的影响 经腋窝皮下注射接种肝癌Walker-256细胞1周后接种部位出现大小约1 cm×1 cm×1 cm瘤体，荷肝癌大鼠瘤体组织呈现质硬、活动、不粘连等特征。与模型组比较，经紫草素治疗14天后荷肝癌大鼠瘤体组织减小、活动度和硬度降低，并且呈现一定剂量依赖性。

2.2 紫草素对荷肝癌大鼠肿瘤组织形态结构的影响 模型组大鼠荷瘤体组织细胞呈椭圆形、胞质饱满、核仁深染，细胞核多以2个或多个呈现，未见异常；与模型组比较，紫草素各剂量组和顺铂组大鼠荷肿瘤组织细胞呈现皱缩、数量减少、间隙增大，肿瘤组织出现不同程度片状坏死区，紫草素各剂量组呈现一定剂量依赖性，见图1。

图1 紫草素对荷肝癌大鼠肿瘤组织形态结构的影响（H E×400）

2.3 紫草素对荷肝癌大鼠抑瘤率的影响 与模型组比较，紫草素［40、20 mg/（kg·d）］或顺铂 2 mg/（kg·d）治疗 14 天能够提高荷肝癌大鼠抑瘤率（P＜0.01）；紫草素（40 mg/（kg·d））组抑瘤率与顺铂组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.4 紫草素对荷肝癌大鼠脾淋巴细胞转化率的影响 与模型组比较，紫草素［40、20 mg/（kg·d）］或顺铂 2 mg/（kg·d）治疗 14天能升高荷肝癌大鼠脾淋巴细胞转化率（P＜0.05）；并且紫草素［40 mg/（kg·d）］组脾淋巴细胞转化率高于顺铂 2 mg/（kg·d）组（P＜0.05），见表 1。

表1 LP对荷肝癌大鼠抑瘤率和脾淋巴细胞转化率的影响（±s） %

表1 LP对荷肝癌大鼠抑瘤率和脾淋巴细胞转化率的影响（±s） %

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与顺铂组比较，△表示P＜0.05

组别 只数 抑瘤率 脾淋巴细胞转化率模型组 20 0.0±0.0 1.03±0.05顺铂 2 m g/（kg·d）组 20 43.6±3.7** 1.21±0.07*紫草素 40 m g/（kg·d）组 20 48.1±4.0** 1.42±0.12**△紫草素 20 m g/（kg·d）组 20 32.2±3.5** 1.23±0.09*紫草素 10 m g/（kg·d）组 20 21.8±2.6** 1.18±0.12

2.5 紫草素对荷肝癌大鼠血清中炎症因子水平的影响 与模型组比较，紫草素［40、20 mg/（kg·d）］或顺铂 2 mg/（kg·d）治疗14天能降低荷肝癌大鼠血清IL-2、TNF-α含量（P＜0.05）；并且紫草素［40 mg/（kg·d）］组 IL-2 含量低于顺铂 2 mg/（kg·d）组，TNF-α含量2组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 紫草素对荷肝癌大鼠血清中炎症因子水平的影响（±s） pg/m L

表2 紫草素对荷肝癌大鼠血清中炎症因子水平的影响（±s） pg/m L

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与顺铂组比较，△表示P＜0.05

组别 只数 IL-2 TN F-α模型组 20 109.7±18.5 228.7±30.4顺铂 2 m g/（kg·d）组 20 78.4±13.2** 127.4±19.2**紫草素40 m g/（kg·d）组 20 62.1±10.3**△ 138.5±21.3**紫草素 20 m g/（kg·d）组 20 85.9±16.0* 180.9±25.6*紫草素 10 m g/（kg·d）组 20 101.7±19.5 206.7±31.8

2.6 紫草素对荷肝癌大鼠血液CD 4+、CD 8+百分率及CD 4+/CD 8+比值的影响 与模型组比较，紫草素［40 mg/（kg·d）］或顺铂2 mg/（kg·d）治疗14天能提高荷肝癌大鼠血液CD4+百分率（P＜0.05），经紫草素［40、20 mg/（kg·d）］或顺铂 2mg/（kg·d）治疗14天能降低CD8+百分率并提高CD4+/CD8+比值（P＜0.05）；紫草素［40 mg/（kg·d）］组 CD4+、CD8+百分率和 CD4+/CD8+比值与顺铂组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3、图2。

表3 紫草素对荷肝癌大鼠血液中CD 4+、CD 8+百分率及 CD 4+/CD 8+比值的影响（±s）

表3 紫草素对荷肝癌大鼠血液中CD 4+、CD 8+百分率及 CD 4+/CD 8+比值的影响（±s）

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

组别 只数 CD 4+/% CD 8+/% CD 4+/CD 8+模型组 20 21.2±5.3 23.8±7.6 0.89±0.34顺铂 2 m g/（kg·d）组 20 28.0±6.5* 17.3±5.9**1.62±0.51**紫草素 40 m g/（kg·d）组 20 26.8±5.2* 16.9±5.4**1.59±0.48**紫草素 20 m g/（kg·d）组 20 23.1±6.8 20.1±7.3* 1.15±0.36*紫草素 10 m g/（kg·d）组 20 22.4±5.7 21.8±7.6 1.03±0.40

图2 紫草素对荷肝癌大鼠血液中CD 4+、CD 8+百分率的影响

3 讨论

肝癌具有发病隐匿、转移及侵袭能力强、进展迅速、恶性度高等特点，多数患者就诊时已达病程中晚期，失去手术机会，目前临床手术切除率仅为20%［5］，且5年复发率高达 60%以上，而肿瘤患者免疫系统功能抑制使肿瘤细胞易于生长和转移是其复发的主要原因之一［1-2］。

紫草素是一种具有广泛生物学活性的萘醌类化合物［3-4］，对乳腺癌、喉癌、子宫内膜癌、宫颈癌、白血病等具有一定的抑制作用［6-10］。代巧妹等［4］报道紫草素具有改善机体免疫功能的作用。本研究发现紫草素干预14天能有效降低瘤体活动度和硬度，诱导肿瘤组织细胞凋亡或坏死，提高抑瘤率，降低瘤体重量，提示紫草素对荷肝癌大鼠瘤体生长具有一定的抑制作用。

脾淋巴细胞转化百分率是反映机体细胞免疫功能的基本指标［11］，也是研究药物对T淋巴细胞影响的常用方法。IL-2具有促进肿瘤细胞免疫耐受的作用，其对免疫功能的影响与各型免疫细胞所处的状态、IL-2浓度及作用时间等因素密切相关［12-13］。Anquetil 等［14］研究发现，机体出现癌症病变后体内TNF-α合成及分泌增加，而TNF-α能够抑制IgG和lgM的产生，能导致T淋巴细胞不能对肿瘤细胞产生正常的免疫反应。T淋巴细胞CD4+和CD8+分子共同介导细胞免疫应答反应［15］，CD4+/CD8+比值在机体免疫调节中具有重要作用，其比值变化能准确反映机体免疫状态［16-17］。本研究发现紫草素干预14天能够有效提高荷肝癌大鼠脾淋巴细胞转化率，降低IL-2、TNF-α含量，提高CD4+百分率，降低CD8+百分率，提高CD4+/CD8+比值，提示紫草素具有提高荷肝癌大鼠免疫功能的作用。

总之，紫草素可能通过改善荷肝癌大鼠免疫功能而对瘤体生长起到一定的抑制作用；其机制可能与紫草素能够有效提高脾淋巴细胞转化率，降低IL-2、TNF-α含量，提高T淋巴细胞亚群CD4+百分率，降低CD8+百分率和提高CD4+/CD8+比值有关。