玉米须总皂苷对非酒精性脂肪肝大鼠SREBP1c和ACCα的影响*

余 渊，程 杰

1鄂东医疗集团黄石市中心医院，湖北 黄石 435000；2黄石市爱康医院

非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）主要是指一类非酒精因素所引起的肝脏细胞脂肪变化症状，本病与超重、肥胖以及高脂血症关系密切，固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1C）；乙酰辅酶羧化酶 α（ACCα）是诱发 NAFLD的主要原因［1］。关于NAFLD的治疗，过去的研究认为应以调节饮食和增加运动为主，药物治疗为辅，但最新研究认为，通过饮食和运动虽可有效预防非酒精性脂肪肝病肝脏脂肪的排出，对于已受损细胞并无修复作用，因此加强药物治疗仍十分必要［2］。近年来玉米须总皂苷对2型糖尿病的作用受到了许多学者的关注［3］，由于2型糖尿病和非酒精性脂肪肝病有一个明显共同点即胰岛素抵抗的升高［4］，因此玉米须总皂苷可能对非酒精性脂肪肝病有一定作用。本研究采用高脂高糖饮食建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型，观察玉米须总皂苷对非酒精性脂肪肝病是否有治疗作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和饲养环境 清洁级Sprague Dawley雄性大鼠100只，体质量为180～220 g，购于华中科技大学动物实验中心，大鼠合格证号：SCXK（鄂）2010-0007。

1.2 高脂饲料组成 基础饲料和高脂饲料及饲养用垫料均购于华中科技大学动物实验中心。基础饲料配方主要为碳水化合物60%，蛋白质22%，粗纤维5.6%，脂肪2.4%，其他10.0%；高糖、高脂饲料组成：基础饲料66.5%，蔗糖10%，猪油20%，胆固醇3.4%，胆酸钠0.1%。1.3 试剂与药品 玉米须总皂苷（ZMLS）由华中科技大学同济医学院提供（纯度98%）；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）试剂盒以及游离脂肪酸（FFA）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；戊巴比妥钠和肝脏固醇调节元件结合蛋白 1c（SREBP1c）和乙酰辅酶羧化酶 α（ACCα）多克隆抗体以及b-actin单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；抗体稀释液、二抗、DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司；多聚甲醛购于上海化学试剂有限公司。

1.4 方法

1.4.1 分组及造模 大鼠适应性喂养2周后随机分为正常组，模型组以及治疗组，每组20只。模型组和治疗组给予高脂高糖饮食8周建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型，模型建立成功的标志为血液生化指标检测大鼠肝功能异常，同时肝脏组织HE染色有明显的脂肪空泡。

1.4.2 灌胃给药 大鼠模型建立成功后治疗组予玉米须总皂苷4 mg/（kg·d）灌胃，正常组和模型组予生理盐水灌胃，分别于治疗4、8周后处死大鼠，观察治疗效果。

1.4.3 肝脏组织分离及固定 在治疗4周和8周后分别予戊巴比妥钠（3%）30 mg/（kg·d）腹腔注射处死大鼠各半，腹腔注射戊巴比妥钠约5分钟后将麻醉大鼠固定于解剖板上，沿腹中线切开，暴露腹腔，取出肝脏，并统一取肝左叶置于中性福尔马林溶液中保存备用，其他置于超低温冰箱中保存备用。

1.4.4 生化指标的检测 摘除大鼠肝脏后用10 mL注射器沿心尖处抽取血液并置于1.5 mL离心管中，4 000 rpm离心15分钟，取上清液保存于超低温冰箱备用。

1.4.5 H E染色 将心肌组织从4%的福尔马林中取出，脱水、石蜡包埋、切片、最后进行HE染色，染色后使用光学显微镜观察心肌组织病理学改变。

1.4.6 RT-PCR法检测SREBP1c和A CCα基因表达 采用总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司提供）提取肝脏中总RNA，提取完成后取2 μg RNA进行逆转录，逆转率完成后扩增，扩增条件：94℃预变性 2分钟，94℃变性 30秒，SREBP1c 48.6℃退火 30s（ACCα46.8℃退火 30 秒），72℃延伸2分钟，共35个循环；最后72℃总延伸5分钟。完成后每组各取5 μL PCR产物，0.5%的琼脂糖电泳，最后采用凝胶成像仪采集图像，Image J计算每个条带荧光强度值，每组实验重复3次，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4.7 蛋白免疫印迹法（W est ern bl ot t i ng）检测肝脏组织SREBPl c和A CCa的表达 组织细胞裂解液裂解肝脏组织后离心提取总蛋白，每组各取60 μg以10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离。电泳完成后立即转移蛋白至PVDF膜（半干转移法），转移完成后3%脱脂牛奶封闭2小时，完成后加入相应1抗（1∶1500）封闭袋中摇床1小时，之后置于4℃冰箱中过夜孵育；次日洗涤3次后加入相应二抗（l∶3000）孵育2小时，洗涤3次后立即进行化学发光法曝光，之后压片。采用凝胶图像分析系统检测蛋白质印迹条带灰度，每组实验重复3次。

1.5 统计学方法 采用SPSS l9.0统计学软件分析数据，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 正常组大鼠毛发顺畅发白，饮食、饮水正常，活泼好动；模型组大鼠饮食和饮水量均较大，毛发沾有黄色尿液，呈明显的肥胖特征；治疗组大鼠一般情况介于空白组和模型组之间。

2.2 A ST和A LT变化情况 与正常组相比，模型组大鼠AST和ALT升高（P＜0.05）；与模型组相比，治疗4周后，治疗组大鼠AST和ALT下降（P＜0.05），治疗8周后效果更显著（P＜0.05），见表2。

2.3 血脂水平 与正常组相比，模型组TG和FFA升高（P＜0.05）；与模型组相比，治疗4周后治疗组大鼠TG和FFA均下降（P＜0.05），治疗8周后进一步降低（P＜0.05），见表 3。

表2 各组大鼠A ST、A LT变化情况（±s） U/L

表2 各组大鼠A ST、A LT变化情况（±s） U/L

注：*表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 A ST A LT治疗4周后 治疗8周后 治疗4周后 治疗8周后正常组 10 115.45±12.14 116.38±10.43 34.23±4.26 36.56±3.92模型组 10 234.33±42.54 228.21±33.56 76.34±14.26 75.42±12.54治疗组 10 173.17±21.33* 142.17±12.78* 58.27±8.15* 48.87±9.47*

表3 各组大鼠TG、FFA变化情况（±s） m m ol/L

表3 各组大鼠TG、FFA变化情况（±s） m m ol/L

注：*表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 TG FFA治疗4周后 治疗8周后 治疗4周后 治疗8周后正常组 10 0.70±0.12 0.69±0.11 0.45±0.06 0.44±0.08模型组 10 1.23±0.26 1.26±0.27 1.12±0.18 1.54±0.13治疗组 10 1.02±0.16* 0.92±0.12* 0.89±0.12* 0.82±0.12*

2.4 H E染色 正常组大鼠肝脏肝细胞结构纹理清晰，均以中央静脉放射状排列，同时细胞大小一致，排列整齐。模型组大鼠表现明显的肝小叶结构破坏，肝细胞肿大，肝组织有大量的脂肪空泡和脂肪变性，细胞核明显增大，玉米须总皂苷治疗4周后大鼠肝细胞仍有一定的肿胀和脂肪变性，治疗8周后只有小而少的脂肪空泡，肝细胞大小基本恢复正常，见图1。

图1 肝脏组织H E染色（10×20）

2.5 SREBP1c和A CCα蛋白表达 与正常组相比，模型组大鼠SREBP1c和ACCα蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组相比，治疗4周后治疗组大鼠SREBP1c和ACCα蛋白含量降低（P＜0.05），治疗8周后进一步降低（P＜0.05），见表4及图2。

表4 治疗后大鼠肝脏SREBP1c和A CCα蛋白相对表达量（±s）

表4 治疗后大鼠肝脏SREBP1c和A CCα蛋白相对表达量（±s）

注：*表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 SREBP1c A CCα治疗4周后 治疗8周后 治疗4周后 治疗8周后正常组 10 0.72±0.15 0.98±0.11 0.92±0.15 0.64±0.13模型组 10 2.65±0.51 2.24±0.41 2.74±0.43 2.54±0.41治疗组 10 1.82±0.35* 1.03±0.21* 1.54±0.26* 0.91±0.15*

图2 大鼠肝脏SREBP1c和A CCα蛋白表达

2.6 SREBP1c和A CCα m RN A表达 与正常组相比，模型组大鼠SREBP1c和ACCα mRNA表达升高（P＜0.05）；与模型组相比，治疗4周后治疗组大鼠表达下降（P＜0.05），治疗8周后进一步下降（P＜0.05），见表5及图3。

表5 治疗后大鼠肝脏SREBP1c和A CCα m N N A相对表达量（±s）

表5 治疗后大鼠肝脏SREBP1c和A CCα m N N A相对表达量（±s）

注：*表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 SREBP1c A CCα治疗4周后 治疗8周后 治疗4周后 治疗8周后正常组 10 0.77±0.12 0.85±0.22 1.23±0.21 0.76±0.15模型组 10 2.74±0.43 2.43±0.42 2.92±0.51 2.61±0.47治疗组 10 2.01±0.22* 0.93±0.20* 2.11±0.19* 0.81±0.21*

图3 大鼠肝脏SREBP1c和A CCα m RN A相对表达

3 讨论

肝脏是人体最重要的代谢器官，其在体内负责糖、脂肪和蛋白质的代谢与合成，由于脂肪本身属于能量贮存物质，所以当不能完全代谢吸收的脂肪超过了肝脏能清除的脂类，就可造成其在肝脏细胞中的过量聚集，最终导致脂肪肝［5］。脂肪肝病是全世界范围内广泛流行的疾病，这与人们饮食摄入的增加（非酒精性脂肪肝）或者过量饮酒（酒精性脂肪肝）密切相关［6］。有研究［7］显示，非酒精性脂肪肝病在世界范围内广泛流行，以西方发达国家为例，其非酒精性脂肪肝病发病率约为20%～30%，其中西班牙人高达45%，我国属于发展中国家，发病率相对较低，但也高达12%～24%。其中10%的患者在20年内可发展为肝纤维化，而在肝纤维化的人群中又有30%可在10年内发展为肝硬化，因此非酒精性脂肪肝病已成为威胁人们健康的一大疾病。

关于非酒精性脂肪肝的发生，目前研究认为脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗、炎症和氧化应激等均参与了其发生或发展［8］，而非酒精性脂肪肝病本身属于脂代谢类疾病，因此不管是外因刺激，还是本身病变，研究调节脂代谢的药物对于本病的治疗具有积极意义［9-11］。而脂质代谢在体内一般有α、β和γ3条氧化通路［11］，其中α氧化通路是研究最为广泛也是最为核心的通路之一［12］，目前以 SREBP1c、ACCα为治疗非酒精性脂肪病靶点的研究较多［13-14］，如武俊紫等［15］研究报道富硒灵芝可调节肝脏组织中ACCα的表达，但对SREBF-1c无直接作用；孙蔚明［16］研究报道红芪多糖可改善非酒精性脂肪肝病SREBP1c和ACCα的表达，但关于玉米须总皂苷对2型糖尿病SREBP1c和ACCα的作用目前还没有报道。

我国是玉米种植大国，早在古代，就有中医专家采用玉米须治疗糖尿病的研究，近年来随着分子生物学和细胞生物学的发展，进一步证实了玉米须的作用，其不仅能降糖，同时对降脂特别是降低体内胆固醇具有较好疗效［17-18］。此外，玉米须总皂苷和玉米须多糖都有一定的降脂作用，而其中发挥主要作用的为玉米须总皂苷［19］。本研究结果显示，玉米须总皂苷可明显改善非酒精性脂肪肝病大鼠FFA和TG，表明玉米须总皂苷可调节2型糖尿病大鼠血脂功能，玉米须总皂苷可明显降低大鼠AST和ALT，对肝功能具有较好的作用，此外，玉米须总皂苷可明显降低2型糖尿病SREBP1c和ACCα的表达，提示玉米须总皂苷对大鼠肝脏中α氧化相关酶具有一定的调节作用。

玉米须总皂苷对非酒精性脂肪肝病大鼠肝功能和血脂具有很好的调节作用，这可能与其可调节α氧化关键酶SREBP1c和ACCα的表达有关。